Здесь мы представляем протокол исследования внутриклеточных механических свойств изолированных эмбриональных клеток рыбок данио в трехмерном заключении с прямым измерением силы оптической ловушкой.
Во время развития многоклеточного организма одна оплодотворенная клетка делится и дает начало множественным тканям с разнообразными функциями. Тканевый морфогенез идет рука об руку с молекулярными и структурными изменениями на уровне одной клетки, которые приводят к изменениям субклеточных механических свойств. Как следствие, даже внутри одной клетки разные органеллы и компартменты по-разному противостоят механическим воздействиям; и пути механотрансдукции могут активно регулировать свои механические свойства. Таким образом, способность клетки адаптироваться к микроокружению тканевой ниши частично обусловлена способностью ощущать и реагировать на механические напряжения. Недавно мы предложили новую парадигму механосенсации, в которой ядерная деформация и позиционирование позволяют клетке измерять физическую 3D-среду и наделяют клетку чувством проприоцепции для декодирования изменений в форме клеток. В этой статье мы опишем новый метод измерения сил и свойств материала, которые формируют ядро клетки внутри живых клеток, на примере адгезивных клеток и механически ограниченных клеток. Измерения могут быть выполнены неинвазивно с оптическими ловушками внутри клеток, а силы напрямую доступны через безкалибровочное обнаружение светового импульса. Это позволяет измерять механику ядра независимо от деформаций клеточной поверхности и позволяет рассеивать пути экстероцептивной и интероцептивной механотрансдукции. Важно отметить, что эксперимент по улавливанию может быть объединен с оптической микроскопией для исследования клеточного ответа и субклеточной динамики с использованием флуоресцентной визуализации цитоскелета, ионов кальция или ядерной морфологии. Представленный метод прост в применении, совместим с коммерческими решениями для измерения силы и может быть легко расширен для исследования механики других субклеточных компартментов, например, митохондрий, стресс-волокон и эндосом.
Тканевый морфогенез представляет собой сложный процесс, при котором биохимические сигналы и физические силы пространственно-временно координируются. У развивающегося эмбриона градиенты биохимических сигнальных факторов диктуют специфику судьбы и обеспечивают правильную структуру тканей1,2. В то же время внутренние и внешние силы играют определенную роль в построении архитектуры эмбриона3,4. Влияние механики клеточной коры в этом контексте было широко изучено5,6. Тесная взаимосвязь между механохимическими процессами во время морфогенеза зависит от свойств отдельных клеток ощущать и реагировать на механические силы в микроокружении их тканей. Клетки, таким образом, декодируют механические сигналы через присутствие чувствительных к силе субклеточных и молекулярных элементов, которые преобразуют механическую информацию в конкретные сигнальные пути, контролирующие поведение клеток, судьбу клеток и клеточную механику.
Отличительной чертой процессов развития является то, что клетки организуются в группы для построения многоклеточных структур. Таким образом, одиночные клетки редко перестраиваются и движутся в одиночку, но связаны в плотном социотопе, в котором они демонстрируют коллективное поведение, такое как надклеточная миграция7, (не)глушащие переходы8,9 или уплотнение бластоцисты10. Механические силы, генерируемые внутри и между клетками, служат важными сигналами для управления коллективной динамикой клеток7,11. Но даже когда клетки движутся в одиночку, такие как клетки-предшественники, которые протискиваются между тканевыми листами или узкими тканевыми нишами, они испытывают обширные анизотропные механические силы при навигации по трехмерной среде. Эти механические нагрузки на клетки оказывают глубокое воздействие на поведение клеток12,13. Было исследовано несколько механизмов, которые сходятся на ядре как основной элемент механотрансдукции14,15, как пассивный или активный механический элемент во время миграции в плотной среде 3D-ткани15,16.
Недавно мы предложили механизм, который оснащает клетки для измерения деформаций формы с использованием ядра в качестве эластичного внутриклеточного механо-калибра12. Ядро, будучи самой большой органеллой в клетке, подвергается большим деформациям, когда клетки поляризуются, мигрируют или изменяют свою форму при механическом растяжении, ограничении или осмотическом напряжении16,17,18,19. Мы обнаружили, что растяжение ядерной оболочки вместе с внутриклеточным позиционированием ядра предоставляет клеткам информацию о величине и типе клеточной деформации (например, сжатие клеток против клеточного набухания). Растяжение ядра связано с развертыванием внутренней ядерной мембраны (INM), что способствует кальций-зависимой активности cPLA2 (цитозольная фосфолипаза A2) липазы в INM с последующим высвобождением арахидоновой кислоты (AA) и быстрой активацией миозина II в клеточной коре. Это приводит к повышенной сократимости клеток и миграции амебоидных клеток выше порога сократимости коры6. Механочувствительная реакция на деформацию клеток происходит менее чем за минуту и обратима при высвобождении удержания, предполагая, что ядро действует как тензорезистор клеточной проприоцепции, регулирующий адаптивное поведение клеток в условиях механического стресса. Показано, что этот механочувствительный путь активен в стволовых клетках-предшественниках, полученных из эмбрионов рыбок данио, как в плюрипотентных, так и в линейных клетках12 и сохраняется у различных видов и клеточных линий20.
В дополнение к ядерным свойствам в качестве клеточного механосенсора, ядерная архитектура и механика внутренне регулируются во время разработки и в ответ на спецификацию клеточной судьбы21, следовательно, настраивая клеточную механочувствительность22,23. Следствием этого может стать изменение в ядерном соответствии, которое допускает морфологические изменения и переходы из преимущественного в миграционное состояние и наоборот8.
Было применено несколько методов измерения механики клеточного ядра, таких как атомно-силовая микроскопия24,25, аспирация микропипетки26,27, микрофлюидная технология28 и микроиглы29. Однако многие из этих методов являются инвазивными в том смысле, что вся клетка должна быть деформирована, ограничивая измерение механических характеристик и силозависимых реакций самого ядра. Для обхода одновременной деформации поверхности клетки и ее механочувствительной клеточной коры30 изучали изолированные ядра в различных контекстах31,32. Однако нельзя исключать, что ядерная изоляция связана с изменением свойств механических ядер и их регуляции (ссылка24 и собственные неопубликованные наблюдения).
Оптический пинцет (OT) является универсальной технологией, которая позволила провести множество экспериментов в клеточной механобиологии и сыграла важную роль в нашем понимании того, как молекулярные машины преобразуют химическую энергию в механическую33,34. Оптический пинцет использует плотно сфокусированный лазерный луч для воздействия оптических сил на диэлектрические частицы, которые имеют показатель преломления выше, чем окружающая среда33. Такие силы могут составлять порядка сотен пиконьютонов и приводить к эффективному удержанию частицы в фокусе лазерной ловушки, что позволяет манипулировать захваченной частицей в трех измерениях. Использование света имеет важное преимущество в том, что измерение может быть выполнено неинвазивно внутри живых клеток. Оптические манипуляции дополнительно ограничиваются фокусом ловушки лазерного луча. Следовательно, манипуляция может быть выполнена без стимуляции окружающих клеточных мембран и не нарушает актиновую кору или механочувствительные процессы на плазматической мембране, такие как силозависимая активация ионных каналов.
Сложность подхода оптического пинцета заключается в точном определении сил, приложенных к микросфере, с использованием классических подходов, которые полагаются на калибровку косвенной силы на основе теоремы о равнораспределении или использование определенных сил сопротивления Стокса для измерения лазерной силы убегания35. Хотя эти методы легко реализовать в эксперименте in vitro, они обычно не могут быть переведены в клеточную среду. В этой области было введено несколько стратегий, основанных на калибровке прямой силы, полученной из первых принципов сохранения импульса36,37. В отличие от других подходов силовой спектроскопии, измерения силы выводятся из локального обмена световым импульсом с захваченной частицей произвольной формы38,39. В нашей экспериментальной установке изменения светового импульса, возникающие в результате оптических сил, непосредственно измеряются без необходимости калибровки ловушки de situ40,41,42,43. Таким образом, измерения становятся возможными в вязкой среде, такой как внутренняя часть клетки или даже внутри ткани, и силы могут быть легко количественно оценены вплоть до уровня pN.
В этом протоколе мы описываем анализ для механического манипулирования внутриклеточными органеллами или структурами и количественной оценки их механических свойств с помощью оптической установки пинцета. Эта установка интегрирована во вращающийся дисковый флуоресцентный микроскоп, позволяющий параллельно визуализировать поведение клеток или внутриклеточную динамику. Анализ позволяет охарактеризовать механические свойства конкретных клеточных компартментов, таких как ядро, одновременно изучая возможный механореспонгс и активацию молекулярных сигнальных путей в результате самой деформации. Кроме того, оптическое улавливание введенных микрошариков внутри клеток позволяет увеличить силу углубления благодаря значительно более высокому показателю преломления полистирольной бусины (n = 1,59) по сравнению с внутренним преломляющим контрастом44 ядра (n ~ 1,35) по сравнению с цитоплазмой (n ~ 1,38). Представленная стратегия может быть легко адаптирована к изучению других внутриклеточных структур и органелл, а также других подходов, включающих активную микрореологию, использование нескольких оптических ловушек для одновременного зондирования одних и тех же/разных субклеточных структур и измерения, нацеленные на клеточную механобиологию у живого эмбриона.
В этом протоколе мы описываем уникальный метод опроса механических свойств клеточного ядра внутри живых клеток. В отличие от других методов силовой спектроскопии, неинвазивное оптическое улавливание позволило отделить вклад клеточной мембраны и цитоскелета от жесткости клеточного ядра. Важно отметить, что оптическая микроманипуляция совместима с мультимодальной микроскопией, что позволит экспериментатору изучать различные процессы, участвующие в клеточной ядерной механобиологии. В качестве репрезентативного результата мы использовали окрашивание ДНК-Хёхста для измерения деформации ядра при вдавливании, выполненном силами порядка нескольких сотен пикоНьютонов.
Потенциальные применения нашего метода за пределами примеров, изложенных в этом протоколе
Возможность извлекать количественную механическую информацию из измерений внутри живых клеток без внешних возмущений обеспечивает множество беспрецедентных возможностей, которые только начинают изучаться. Таким образом, представленный протокол нашей оптической платформы микроманипуляции может быть распространен на более сложные эксперименты с большой универсальностью. Акустооптические дефлекторы (AOD) могут генерировать несколько оптических ловушек для синхронных измерений силы в различных местах расположения ячеек, а также могут использоваться для активной микрореологии в широком диапазоне частот51,61. Как уже упоминалось, силовой отклик при отступе может преодолеть максимальную силу захвата, что приводит к выходу шарика из оптической ловушки. В этом случае силовая обратная связь может быть сконфигурирована с помощью AOD для того, чтобы зажать оптическую силу. В целом, несколько микрореологических подходов, таких как релаксация стресса, описанная в этом протоколе, а также активная микрореология или соответствие ползучести, могут быть экспериментально получены с помощью этой платформы и тщательно проанализированы новыми пакетами программного обеспечения61,62,63,64,65 . Кроме того, применение сил не ограничивается ядром, но в принципе может быть осуществлено для измерения различных внутриклеточных структур и в сложных тканях, как показано для улавливания протекающих красных кровяных клеток внутри интактных кровеносных сосудов66,67 или захвата и деформирования хлоропластов и митохондрий68 . Калибровка светового импульса не зависит от формы и размера захваченного объекта, что позволяет проводить прямые измерения силы на любом силовом зонде произвольной формы38,39. Использование инъекционных микросфер позволило приложить к ядру высокие силы при относительно низкой мощности лазера по сравнению с прямым манипулированием клеточными структурами69,70,71. Однако, учитывая достаточно высокую разницу в показателях преломления, нет необходимости в внешнем силовом зонде, и внутриклеточными органеллами можно манипулировать непосредственно без инъекционных шариков (неопубликованные наблюдения и ссылка70).
Потенциальные модификации нашего метода для расширения приложений
Различные размеры микрошариков могут быть введены в зависимости от эксперимента, но относительный контроль должен быть выполнен. Например, для изучения клеток на более поздних стадиях могут быть введены более мелкие шарики. Это уменьшит максимальную силу, которая может быть приложена оптической ловушкой (как показано в ссылке 55). Большие бусины могут быть введены для оказания более высоких сил, но они могут повлиять на развитие эмбриона в зависимости от их размера или стадии интереса. В экспериментах, где инъекция микрогранул не является вариантом, различными органеллами, показывающими различия в показателях преломления по сравнению с цитоплазмой, все еще можно оптически манипулировать, что приводит к оптическим силам, измеряемым из изменений светового импульса42. Как упоминалось выше, эти методы были использованы Bambardekar et al. для деформирования клеточно-клеточных соединений в эмбрионе Drosophila70. Аналогичным образом, ядро клетки имеет более низкий показатель преломления, чем окружающая среда44, что позволяет проводить отступ без шариков (неопубликованные наблюдения и ссылка72), хотя и с более низкой силой захвата. Таким образом, ядро не может быть легко захвачено и выходит из ловушки.
Распорка PDMS со спиновым покрытием изготавливается удобным и быстрым методом, но может быть недоступна для лабораторий, не имеющих доступа к микро-/ нанопроизводственному оборудованию или инженерным лабораториям. Таким образом, распорка может быть легко собрана из лабораторной ленты или парапленки (шаг 4). Протокол также может быть адаптирован путем изготовления микрофлюидных каналов, которые автоматизируют доставку отдельных ячеек в предопределенные измерительные колодцы или в камеру с определенной высотой для оценки эффекта удержания в пределах одного и того же образца. Однако такие микрофлюидные устройства должны быть сконструированы таким образом, чтобы они соответствовали пространству между объективом микроскопа и собирающей линзой датчика оптической силы около 2 мм (см. шаг 3). Обратите внимание, что датчик оптической силы должен быть расположен на соответствующей высоте таким образом, чтобы оптические аберрации от расфокусировки не влияли на измерение импульса фотона.
Другие модификации могут включать смену биологических репортеров. Мы обнаружили, что флуоресценция Хёхста спектрально просачивается в канал GFP, и поэтому мы предпочитаем комбинацию с гистоном, помеченным mCherry, в качестве ядерного маркера для одновременного измерения в двух флуоресцентных каналах. В качестве альтернативы, ядерная деформация может быть легко отслежена с помощью метки, направленной на внутреннюю ядерную мембрану, такую как Lap2b-GFP (рисунок 2).
Углубление на ядро клетки составляло порядка 2-3 микрон, что мы могли точно измерить с помощью анализа изображений дифракционно-ограниченной спиннинг-дисковой конфокальной микроскопии. В случае более жестких ядер или меньших сил отступ будет едва ли измеримым при использовании этого подхода. Тем не менее, абсолютный силовой калиброванный оптический пинцет также может быть откалиброван для измерения положения захваченной бусины in situ с использованием интерферометрии BFP с нанометровой точностью51. Используя этот подход, сигнал напряжения и датчик оптической силы могут быть переведены в положение захваченного зонда через параметр β [нм / В], в то время как инвариантный параметр α [pN / V] дает значения силы через вышеупомянутую калибровку светового импульса41 (см. Ниже для деталей).
Устранение неполадок
Мы обнаружили, что во время эксперимента могут возникнуть следующие проблемы:
Не образуется стабильная ловушка, и микросфера легко выходит
Любая грязь на объективе микроскопа или смещенный коррекционный ошейник могут привести к выходу из строя стабильной ловушки. Если немедленное решение не найдено, измерьте функцию точечного распространения объектива. Если интересующий образец находится глубоко внутри оптически плотной ткани, лазерный фокус может испытывать серьезные оптические аберрации, приводящие к нестабильному захвату (этот эффект обычно незначителен в изолированных клетках, но становится более очевидным в более толстых тканях). Для высокой жесткости восстанавливающая сила ядра может превышать силу выхода ловушки, так что микросфера теряется, а процедура отступа выходит из строя. Первоначально край ядерной мембраны, близкий к оптической ловушке, почти не отступает (рисунок S2A). Когда это происходит, на улавливающий лазер больше не воздействуют сила и броуновское движение, что приводит к падению силы до нуля и уменьшению шума сигнала (рисунок S2B). В случае, если это произойдет, мощность лазера может быть увеличена, чтобы иметь более сильную ловушку, амплитуда трапециевидной траектории, толкающей шарик в ядро, может быть уменьшена, или исходное положение захваченной микрогранулы может быть установлено дальше от ядра.
Клетка движется во время стимуляции
Если клетки недостаточно прикреплены, оптическая градиентная ловушка будет перемещать клетки во время выполнения процедуры внутриклеточного отступа, так что силы и основная механика ядра являются артефактными. Чтобы предотвратить смещение всей клетки, мы рекомендуем увеличить концентрацию молекул клеточной адгезии на поверхности, например, ConA.
Компенсация начального импульса
Если в платформе КН отсутствует процедура компенсации начального импульса (этап 6.5), необходимо скорректировать искусственный, не зависящий от силы базовый сигнал. Это видно как наклон на кривой силы даже без захвата бусины (рисунок S1E). Чтобы сделать коррекцию, ту же траекторию нужно выполнить без шарика, вне ячейки в точно таком же положении. Для этого отодвиньте ячейку от ловушки с помощью элемента управления stage. В качестве ориентира, смещение силы изменяется на 5 пН по FOV при 200 мВт в нашей системе; таким образом, она становится незначительной для коротких траекторий. Альтернативно, этап пьезосканирования может быть использован для перемещения клеток на образце, оставляя положение лазера постоянным.
Критические шаги представленного протокола
Микросферы должны быть введены на правой, 1-клеточной стадии, чтобы обеспечить максимальное распределение по эмбриону. Бусины не должны быть флуоресцентными, чтобы свет не просачивался в флуоресцентные каналы, используемые для визуализации. Например, даже типичные красно-флуоресцентные шарики хорошо видны в синем канале, используемом для визуализации ядра клетки после окрашивания Хёхста, благодаря их яркости (возбуждение: 405 нм; излучение: 445 нм). Стабильное прикрепление клетки к субстрату имеет решающее значение для предотвращения бокового смещения во время процедуры отступа. Если клетка движется во время рутины, силы недооцениваются. Если это происходит часто, оптимизируйте протокол вложения. Для клеток тканевой культуры другие белки клеточной адгезии, такие как фибронектин, коллаген или поли-L-лизин, приводят к удовлетворительному прикреплению (неопубликованные наблюдения). Во время содержания клетки подвергаются внезапному и сильному механическому воздействию. Это может привести к повреждению клеток, и часто экспериментатор столкнется с лопнувшими клетками, если процедура не проводится осторожно. Кроме того, если высота удержания слишком мала, все клетки пострадают от разрыва ядерной оболочки или необратимого повреждения. Чтобы смягчить их, опустите верхнюю крышку медленнее и/или увеличьте расстояние между крышками.
Ограничения техники и предложения по их преодолению
Явным ограничением методики является проникновение лазерного света в глубокие участки ткани, что приводит к аберрациям и нестабильному улавливанию. Таким образом, нижний предел глубины проникновения зависит от четкости образца, коррекции аберрации, которая может быть использована73 , и применяемой мощности лазера. Следует учитывать, что более высокая мощность лазера приводит к тепловому возбуждению образца в непосредственной близости от микросферы. Тем не менее, нагрев образца, вызванного лазерным пятном длиной волны 1064 нм, сведен к минимуму, чтобы избежать правдоподобного теплового стресса на наших биологических образцах74.
Другим ограничением является максимальная сила, которую можно измерить. Несмотря на то, что прямое обнаружение светового импульса позволяет измерять силу далеко за пределами линейного режима отклика оптической ловушки40,41, максимальная приложенная сила составляет порядка нескольких сотен пиконьютонов. Это ограничено мощностью лазера и последующим порогом повреждения мягкого биологического материала и различиями показателей преломления, которые обычно не превышают 0,1 или 0,344. Было предложено несколько методов для увеличения предела обнаружения силы, например, с использованием структурированного света75, микросфер с антибликовым покрытием76, частиц с высоким показателем преломления77 или высоколегированных квантовых точек78.
ОТ могут использоваться для измерения положения в нанометровом масштабе с помощью интерферометрии BFP, так что положение шарика внутри ловушки составляет Δx = β Sx, где Sx – сигнал напряжения датчика, а β [мкм/В] может быть откалибровано на лету в соответствии с различными протоколами35,54. Для оптического датчика силы можно доказать, что инвариантный коэффициент преобразования напряжения в силу α [pN/V] напрямую связан с β и жесткостью ловушки, k [pN/μm], через α = kβ 37) В экспериментах со смещениями шариков, которые слишком малы, чтобы их можно было обнаружить с помощью оптической визуализации, эта стратегия может быть использована для дополнения измерений силы с обнаружением малого положения. Примером может служить применение экспериментальных процедур, представленных здесь, к очень жестким ядрам, для которых сил при разумной мощности лазера (200-500 мВт) недостаточно для того, чтобы вызвать достаточно большие значения отступа. В этом случае шарик должен быть приведен в контакт с ядром, а жесткость улавливания должна быть откалибрована до измерения (этап 8.6). Отступ d ядра как функция силы может быть косвенно определен как:
d = xtrap – F/k
где xtrap — позиция ловушки. В отличие от инвариантного коэффициента светового импульса α [pN/V], коэффициент β [мкм/В] необходимо калибровать перед каждым экспериментом, поскольку он зависит от многих локальных переменных, определяющих динамику улавливания, таких как размер частиц, размер пятна оптической ловушки и относительные показатели преломления.
The authors have nothing to disclose.
МК признает финансовую поддержку со стороны Министерства экономики и конкурентоспособности Испании в рамках программы Plan Nacional (PGC2018-097882-A-I00), FEDER (EQC2018-005048-P), Severo Ochoa для центров передового опыта в области исследований и разработок (CEX2019-000910-S; RYC-2016-21062), от Fundació Privada Cellex, Fundació Mir-Puig и от Generalitat de Catalunya через CERCA и исследовательскую программу (2017 SGR 1012), в дополнение к финансированию через ERC (MechanoSystems) и HFSP (CDA00023/2018). V.R. признает поддержку со стороны Министерства науки и инноваций Испании партнерству EMBL, Centro de Excelencia Severo Ochoa, Plan Nacional MINECO (BFU2017-86296-P, PID2020-117011GB-I00) и Женералитату Каталонии (CERCA). V.V. признает поддержку со стороны программы ICFOstepstone PhD, финансируемой исследовательской и инновационной программой Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения Марии Склодовской-Кюри 665884. Мы благодарим Арнау Фарре за критическое прочтение рукописи; Марии Марсал за помощь в визуализации и монтаже эмбриона мощностью 24 л.с.л.с.; Сенда Хименес-Дельгадо за поддержку микроинъекций рыбок данио.
#1.5 22 mm cover glasses | Ted Pella | 260148 | |
#1.5 22×60 mm Coverglasses | Ted Pella | 260152 | |
#1.5H glass bottom dishes | Willco | GWST-5040 | |
10-um beads | Supelco | 72986 | |
1-mm glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0020 GC100F-15 | |
1-um polystyrene microbeads | Sigma | 89904 | |
1-um red-fluorescent beads | ThermoFisher | F8816 | |
Agar | ThermoFisher | 16500500 | |
Aqcuisition cameras sCMOS | Andor | Sona-4BV11-UNI | |
Auxiliary camera (Figure 3, AUX) | Blackfly, FLIR | BFS-U3-200S6M-C | |
Calbryte 520 | AAT Bioquest | 520 AM | |
Centrifuge | Eppendorf | 5453000011 | |
Concanavalin A | Sigma | C5275 | |
DMEM | Sigma | D2906 | |
DNA-Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
Double scotch tape | Biesse Adesivi | ||
E3 | 5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 mM MgSO4 | ||
Eclipse Ti2 | Nikon | ||
Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
GPI-GFP | |||
H2A-mCh | |||
Image acquisition software | Fusion-Andor | ||
Immersion Oil | Cargille | Type B: 16484 | |
IR protection googles | Thorlabs | LG1 | |
Lap2b-eGFP | |||
Micro loader pipette | Eppendorf | GELoader | |
Microinjector | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
MicroManager 2.0 | |||
Micromiter slide | ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisions | ||
Mineral oil | Sigma | M3616 | |
Motorized stage | ASI | ||
Needle puller | Sutter instrument Co. | Model P-97 | |
Optical tweezers platform | Impetux Optics | Sensocell | |
OTs software (LightAce) | Impetux Optics | ||
PDMS | Sigma | Sylgard 184 | |
PDMS Curing agent | Sigma | Sylgard 184 | |
Post processing software (Matlab) | Mathworks | ||
RNAse free water | Thermofisher | AM9937 | |
Short-pass dichroic mirror (Figure 3, IR-F) | Semrock | FF01-950/SP-25 | |
Spin-coater | Specialty Coating Systems | Spincoat G3P-8 | |
Spinning-disk confocal microscope | Andor | DragonFly 502 | |
Stereomicroscope | Leica M80 | ||
Triangular microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU1 | |
Universal oven | Memmert | UNB 200 | |
Water immersion objective | Nikon | MRD07602 |