قياسات القوة المباشرة للميكانيكا دون الخلوية في الحبس باستخدام ملاقط بصرية
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا للتحقيق في الخواص الميكانيكية داخل الخلايا لخلايا الزرد الجنينية المعزولة في الحبس ثلاثي الأبعاد مع قياس القوة المباشرة بواسطة مصيدة بصرية.
Abstract
أثناء تطور كائن حي متعدد الخلايا ، تنقسم خلية مخصبة واحدة وتؤدي إلى أنسجة متعددة ذات وظائف متنوعة. يسير مورفوجين الأنسجة جنبا إلى جنب مع التغيرات الجزيئية والهيكلية على مستوى الخلية الواحدة التي تؤدي إلى اختلافات في الخواص الميكانيكية دون الخلوية. ونتيجة لذلك ، حتى داخل نفس الخلية ، تقاوم العضيات والمقصورات المختلفة بشكل مختلف الضغوط الميكانيكية. ويمكن لمسارات النقل الميكانيكي أن تنظم بنشاط خصائصها الميكانيكية. وبالتالي فإن قدرة الخلية على التكيف مع البيئة الدقيقة لمكانة الأنسجة ترجع جزئيا إلى القدرة على الشعور بالضغوط الميكانيكية والاستجابة لها. لقد اقترحنا مؤخرا نموذجا جديدا للإحساس الميكانيكي حيث يمكن التشوه النووي وتحديد المواقع الخلية من قياس بيئة 3D المادية ويمنح الخلية إحساسا بالاستقبال العميق لفك تشفير التغيرات في شكل الخلية. في هذه المقالة ، نصف طريقة جديدة لقياس القوى وخصائص المواد التي تشكل نواة الخلية داخل الخلايا الحية ، والتي تتمثل في الخلايا الملتصقة والخلايا المحصورة ميكانيكيا. يمكن إجراء القياسات بشكل غير جراحي باستخدام مصائد بصرية داخل الخلايا ، ويمكن الوصول إلى القوى مباشرة من خلال الكشف الخالي من المعايرة عن زخم الضوء. وهذا يسمح بقياس ميكانيكا النواة بشكل مستقل عن تشوهات سطح الخلية والسماح بتشريح مسارات النقل الميكانيكي الخافتة والمتقبلة. الأهم من ذلك ، يمكن دمج تجربة الاصطياد مع المجهر الضوئي للتحقيق في الاستجابة الخلوية والديناميكيات دون الخلوية باستخدام التصوير الفلوري للهيكل الخلوي أو أيونات الكالسيوم أو المورفولوجيا النووية. الطريقة المقدمة سهلة التطبيق ، ومتوافقة مع الحلول التجارية لقياسات القوة ، ويمكن توسيعها بسهولة للتحقيق في ميكانيكا المقصورات تحت الخلوية الأخرى ، على سبيل المثال ، الميتوكوندريا ، وألياف الإجهاد ، والاندوسومات.
Introduction
تشكل الأنسجة هو عملية معقدة يتم فيها تنسيق الإشارات الكيميائية الحيوية والقوى الفيزيائية مكانيا وزمانيا. في الجنين النامي ، تملي تدرجات عوامل الإشارات الكيميائية الحيوية مواصفات المصير وتضمن نمط الأنسجة الصحيح1,2. في الوقت نفسه ، تلعب القوى الجوهرية والخارجية دورا في بناء بنية الجنين3,4. تمت دراسة تأثير ميكانيكا قشرة الخلية في هذا السياق على نطاق واسع5,6. يعتمد الترابط الوثيق بين العمليات الميكانيكية والكيميائية أثناء التشكل على خصائص الخلايا المفردة لاستشعار القوى الميكانيكية في بيئتها الدقيقة للأنسجة والاستجابة لها. الخلايا، وبالتالي فك تشفير الإشارات الميكانيكية من خلال وجود عناصر دون خلوية وجزيئية حساسة للقوة التي تنقل المعلومات الميكانيكية إلى مسارات إشارات محددة تتحكم في سلوك الخلية، ومصير الخلية، وميكانيكا الخلايا.
السمة المميزة للعمليات التنموية هي أن الخلايا تنظم كمجموعات لبناء هياكل متعددة الخلايا. وعلى هذا النحو، نادرا ما تعيد الخلايا المفردة ترتيبها وتتحرك بمفردها ولكنها ترتبط ببيئة اجتماعية ضيقة تظهر فيها سلوكا جماعيا مثل الهجرة فوق الخلوية7 أو انتقالات التشويش8,9 أو ضغط الكيسة الأريمية10. تعمل القوى الميكانيكية المتولدة داخل الخلايا وفيما بينها كإشارات مهمة لتوجيه ديناميكيات الخلايا الجماعية7،11. ولكن حتى عندما تتحرك الخلايا بمفردها، مثل الخلايا السلفية التي تشق طريقها بين صفائح الأنسجة أو منافذ الأنسجة الضيقة، فإنها تواجه قوى ميكانيكية متباينة الخواص واسعة النطاق عند التنقل في بيئة ثلاثية الأبعاد. هذه الضغوط الميكانيكية على الخلايا لها عواقب وخيمة على السلوك الخلوي12,13. تم التحقيق في العديد من الآليات التي تتلاقى على النواة كعنصر نقل ميكانيكي رئيسي14,15 ، كعنصر ميكانيكي سلبي أو نشط أثناء الهجرة داخل بيئة نسيجية ثلاثية الأبعاد كثيفة15,16.
اقترحنا مؤخرا آلية تزود الخلايا بقياس تشوهات الشكل باستخدام النواة كمقياس ميكانيكي مرن داخل الخلايا12. تخضع النواة ، كونها أكبر عضية في الخلية ، لتشوهات كبيرة عندما تستقطب الخلايا أو تهاجر أو تغير شكلها تحت التمدد الميكانيكي أو الحبس أو الإجهاد الأسموزي 16،17،18،19. وجدنا أن تمدد الغلاف النووي جنبا إلى جنب مع تحديد المواقع داخل الخلايا للنواة يزود الخلايا بمعلومات عن حجم ونوع تشوه الخلية (مثل ضغط الخلايا مقابل تورم الخلايا). يرتبط تمدد النواة بتكشف الغشاء النووي الداخلي (INM) ، الذي يعزز نشاط الليباز cPLA2 المعتمد على الكالسيوم (الفوسفوليباز الخلوي A2) في INM متبوعا بإطلاق حمض الأراكيدونيك (AA) والتنشيط السريع للميوسين الثاني في قشرة الخلية. وهذا يؤدي إلى زيادة انقباض الخلايا وهجرة الخلايا الأميبية فوق عتبة الانقباض القشري6. تحدث الاستجابة الحساسة الميكانيكية لتشوه الخلايا في أقل من دقيقة ويمكن عكسها عند إطلاق الحبس ، مما يشير إلى أن النواة تعمل كمقياس إجهاد للاستحسان الخلوي الذي ينظم سلوك الخلية التكيفي في ظل ظروف الإجهاد الميكانيكي. ويظهر أن هذا المسار الحساس للميكانيكية نشط في الخلايا الجذعية السلفية المشتقة من أجنة الزرد، سواء في الخلايا متعددة القدرات أو الملتزمة بالنسب12 ويتم حفظه في أنواع وخطوط خلايا مختلفة20.
بالإضافة إلى الخصائص النووية كمحن ميكانيكي للخلايا، يتم تنظيم البنية النووية والميكانيكا بشكل جوهري أثناء التطوير واستجابة لمواصفات مصير الخلية21، وبالتالي ضبط الحساسية الميكانيكية الخلوية22,23. وقد تكون النتيجة تغيرا في الامتثال النووي يسمح بالتغيرات والتحولات المورفولوجية من حالة ما قبل الهجرة إلى حالة الهجرة والعكس بالعكس8.
تم تطبيق العديد من التقنيات لقياس ميكانيكا نواة الخلية، مثل مجهر القوة الذرية24,25، وشفط الأنابيب الدقيقة26،27، وتكنولوجيا الموائع الدقيقة28، والوخز بالإبر الدقيقة29. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه التقنيات غازية بمعنى أنه يجب تشويه الخلية بأكملها ، مما يحد من قياس الخصائص الميكانيكية والاستجابات المعتمدة على القوة للنواة نفسها. للتحايل على التشوه المتزامن لسطح الخلية وقشرة الخلايا الحساسة ميكانيكيا30 ، تمت دراسة النوى المعزولة في سياقات مختلفة31,32. ومع ذلك، لا يمكن استبعاد أن العزل النووي يرتبط بتغير في خصائص النواة الميكانيكية وتنظيمها (المرجع 24 والملاحظات الخاصة غير المنشورة).
الملقط البصري (OTs) هي تقنية متعددة الاستخدامات سمحت بمجموعة كبيرة من التجارب في علم الأحياء الميكانيكية الخلوية وكان لها دور فعال في فهمنا لكيفية تحويل الآلات الجزيئية للطاقة الكيميائية إلى طاقة ميكانيكية33,34. تستخدم الملقط البصري شعاع ليزر مركز بإحكام لممارسة قوى بصرية على الجسيمات العازلة التي لها معامل انكسار أعلى من الوسط المحيط33. يمكن أن تكون هذه القوى في حدود مئات البيكو نيوتن وتؤدي إلى حبس فعال للجسيم داخل تركيز مصيدة الليزر ، مما يتيح التلاعب بالجسيم المحاصر في ثلاثة أبعاد. استخدام الضوء له ميزة مهمة في أنه يمكن إجراء القياس بشكل غير جراحي داخل الخلايا الحية. تقتصر التلاعبات البصرية أيضا على تركيز المصيدة لشعاع الليزر. وبالتالي ، يمكن إجراء التلاعب دون تحفيز الأغشية الخلوية المحيطة ولا يزعج قشرة الأكتين أو العمليات الحساسة الميكانيكية في الغشاء البلازمي ، مثل التنشيط المعتمد على القوة للقنوات الأيونية.
تكمن صعوبة نهج الملقط البصري في التحديد الدقيق للقوى المطبقة على المجهر باستخدام الأساليب الكلاسيكية التي تعتمد على معايرة القوة غير المباشرة استنادا إلى نظرية التقسيم المتساوي أو استخدام قوى سحب ستوكس المحددة لقياس قوة هروب تعتمد على طاقة الليزر35. في حين أن هذه الطرق سهلة التنفيذ في تجربة في المختبر ، إلا أنه لا يمكن ترجمتها عادة إلى بيئة خلوية. تم إدخال العديد من الاستراتيجيات في هذا المجال التي تعتمد على معايرة القوة المباشرة، المستمدة من المبادئ الأولى للحفاظ على الزخم36,37. على عكس أساليب التحليل الطيفي للقوة الأخرى، يتم استنتاج قياسات القوة من تبادل محلي لزخم الضوء مع الجسيم المحاصر على شكل تعسفي38,39. في إعدادنا التجريبي، يتم قياس التغيرات في زخم الضوء الناشئة عن القوى البصرية مباشرة دون الحاجة إلى معايرة المصيدة في الموقع40،41،42،43. وبالتالي ، تصبح القياسات ممكنة في بيئة لزجة مثل الجزء الداخلي من الخلية أو حتى داخل الأنسجة ، ويمكن قياس القوى بسهولة إلى مستوى pN.
في هذا البروتوكول ، نصف فحصا لمعالجة العضيات أو الهياكل داخل الخلايا ميكانيكيا وتقييم خصائصها الميكانيكية كميا بواسطة إعداد ملاقط بصري. تم دمج هذا الإعداد في مجهر الفلورسنت القرص الدوار الذي يتيح التصوير المتوازي للسلوك الخلوي أو الديناميكيات داخل الخلايا. يسمح الفحص بتوصيف الخواص الميكانيكية لمقصورات خلوية محددة ، مثل النواة ، مع دراسة الميكانوريسبونس المحتمل وتنشيط مسارات الإشارات الجزيئية في نفس الوقت نتيجة للتشوه نفسه. وعلاوة على ذلك، فإن الاصطياد البصري للميكروبات المحقونة داخل الخلايا يسمح بزيادة قوة المسافة البادئة بفضل معامل انكسار أعلى بكثير من حبة البوليسترين (n = 1.59) مقارنة بالتباين الانكساري الداخلي44 للنواة (n ~ 1.35) مقابل السيتوبلازم (n ~ 1.38). يمكن تكييف الاستراتيجية المقدمة بسهولة مع دراسة الهياكل والعضيات الأخرى داخل الخلايا ، بالإضافة إلى النهج الأخرى التي تنطوي على علم الأحياء الدقيقة النشط ، واستخدام مصائد بصرية متعددة لفحص نفس الهياكل دون الخلوية / المختلفة في وقت واحد ، والقياسات التي تستهدف علم الأحياء الميكانيكية للخلايا في الجنين الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول ، نصف طريقة فريدة لاستجواب الخواص الميكانيكية لنواة الخلية داخل الخلايا الحية. وخلافا لتقنيات التحليل الطيفي للقوة الأخرى، سمح لنا الاصطياد البصري غير الغازي بفصل مساهمة غشاء الخلية والهيكل الخلوي عن الصلابة النووية للخلية. الأهم من ذلك ، أن المعالجة الدقيقة البصرية متوافقة مع المجهر متعدد الوسائط ، مما سيسمح للمجرب بدراسة العمليات المختلفة التي ينطوي عليها علم الأحياء الميكانيكية النووية للخلايا. كنتيجة تمثيلية ، استخدمنا تلطيخ DNA-Hoechst لقياس تشوه النواة عند المسافة البادئة التي تقوم بها قوى من ترتيب عدة مئات من picoNewton.
التطبيقات المحتملة لطريقتنا تتجاوز الأمثلة الموضحة في هذا البروتوكول
إن إمكانية استخراج المعلومات الميكانيكية الكمية من القياسات داخل الخلايا الحية دون اضطرابات خارجية تمكن من مجموعة كبيرة من الفرص غير المسبوقة التي بدأت للتو في استكشافها. وبالتالي ، يمكن توسيع البروتوكول المقدم لمنصة المعالجة الدقيقة البصرية الخاصة بنا إلى تجارب أكثر تعقيدا مع تنوع كبير. يمكن للانحرافات الصوتية البصرية (AOD) توليد مصائد بصرية متعددة لقياسات القوة المتزامنة عبر مواقع الخلايا المختلفة ، وكذلك يمكن استخدامها في علم الموجات الدقيقة النشط في نطاق تردد واسع51,61. كما ذكرنا ، يمكن لاستجابة القوة عند المسافة البادئة التغلب على أقصى قوة محاصرة ، مما يؤدي إلى هروب الخرزة من المصيدة البصرية. في هذه الحالة ، يمكن تكوين تغذية مرتدة للقوة باستخدام AOD من أجل تثبيت القوة البصرية. الكل في الكل ، يمكن الحصول على مناهج ميكروريولوجية متعددة ، مثل تخفيف الإجهاد الموصوف في هذا البروتوكول ، ولكن أيضا علم الأنسجة الدقيقة النشط أو الامتثال الزحف ، تجريبيا باستخدام هذه المنصة وتحليلها بدقة بواسطة حزم برامج جديدة61،62،63،64،65 . وعلاوة على ذلك، فإن تطبيق القوى لا يقتصر على النواة بل يمكن من حيث المبدأ القيام به لقياس الهياكل المتنوعة داخل الخلايا وفي الأنسجة المعقدة كما هو موضح في حبس خلايا الدم الحمراء المتدفقة داخل الأوعية الدموية السليمة666,67 أو حبس وتشويه البلاستيدات الخضراء والميتوكوندريا68 . تكون معايرة زخم الضوء مستقلة عن شكل وحجم الجسم المحاصر، مما يتيح إجراء قياسات القوة المباشرة على أي مسبار قوة ذي شكل تعسفي38,39. سمح لنا استخدام الميكروسفيرات المحقونة بتطبيق قوى عالية على النواة ذات طاقة ليزر منخفضة نسبيا مقارنة بالتلاعب المباشر بالهياكل الخلوية69,70,71. ومع ذلك ، نظرا لاختلاف معامل الانكسار المرتفع بما فيه الكفاية ، لا يلزم إجراء مسبار قوة مطبق خارجيا ويمكن معالجة العضيات داخل الخلايا مباشرة دون حقن الخرز (ملاحظات غير منشورة ومرجع 70).
التعديلات المحتملة على طريقتنا لتوسيع التطبيقات
يمكن حقن أحجام مختلفة من الميكروبيدات اعتمادا على التجربة ، ولكن يجب إجراء الضوابط النسبية. على سبيل المثال ، لدراسة الخلايا في مراحل لاحقة ، يمكن حقن حبات أصغر. سيؤدي ذلك إلى تقليل القوة القصوى التي يمكن ممارستها بواسطة المصيدة البصرية (كما هو موضح في المرجع 55). يمكن حقن حبات أكبر لممارسة قوى أعلى، ولكنها قد تؤثر على نمو الجنين اعتمادا على حجمها أو مرحلة اهتمامها. في التجارب التي لا يكون فيها حقن الميكروبيد خيارا، لا يزال من الممكن معالجة العضيات المختلفة التي تظهر اختلافات في مؤشرات الانكسار مقارنة بالسيتوبلازم بصريا، مما يؤدي إلى ظهور قوى بصرية قابلة للقياس من تغيرات زخم الضوء42. كما ذكر أعلاه ، تم استخدام هذه الطرق من قبل Bambardekar et al. لتشويه تقاطعات الخلايا الخلوية في جنين ذبابة الفاكهة 70. وبالمثل، فإن نواة الخلية لديها معامل انكسار أقل من الوسط المحيط44، مما يسمح بالمسافة البادئة الخالية من الخرز (الملاحظات غير المنشورة والمرجع 72) على الرغم من أن قوة الاصطياد أقل. وبالتالي ، لا يمكن محاصرة النواة بسهولة وتهرب من الفخ.
يتم تصنيع فاصل PDMS المطلي بالدوران عبر طريقة مريحة وسريعة ولكن قد يكون بعيدا عن متناول المختبرات دون الوصول إلى منشأة تصنيع متناهية الصغر / نانوية أو مختبرات هندسية. وبالتالي ، يمكن تجميع الفاصل بسهولة من شريط المختبر أو parafilm (الخطوة 4). يمكن أيضا تكييف البروتوكول عن طريق تصنيع قنوات الموائع الدقيقة التي تعمل على أتمتة توصيل الخلايا المفردة إلى آبار قياس محددة مسبقا أو إلى غرفة ذات ارتفاع محدد لتقدير تأثير الحبس داخل نفس العينة. ومع ذلك ، يجب تصميم هذه الأجهزة الموائع الدقيقة بحيث تناسب المسافة بين هدف المجهر وعدسة التجميع لمستشعر القوة البصرية ، حوالي 2 مم (انظر الخطوة 3). لاحظ أنه يجب وضع مستشعر القوة البصرية على الارتفاع المناسب بحيث لا تؤثر أي انحرافات بصرية عن إلغاء التركيز البؤري على قياس زخم الفوتون.
ويمكن أن تشمل التعديلات الأخرى تغيير المراسلين البيولوجيين. وجدنا أن Hoechst الفلورية تنزف طيفيا في قناة GFP ، وبالتالي فإننا نفضل الجمع مع هيستون الموسوم ب mCherry كعلامة نووية للقياس المتزامن في قناتين فلوريتين. بدلا من ذلك ، يمكن بسهولة تتبع التشوه النووي باستخدام ملصق يستهدف الغشاء النووي الداخلي مثل Lap2b-GFP (الشكل 2).
كانت المسافة البادئة على نواة الخلية في حدود 2-3 ميكرون ، والتي يمكننا قياسها بدقة عن طريق تحليل صورة المجهر البؤري المحدود للقرص الغزل المحدود الحيود. بالنسبة لحالة النوى الأكثر صلابة أو القوى الأصغر ، فإن المسافة البادئة ستكون بالكاد قابلة للقياس باستخدام هذا النهج. ومع ذلك، يمكن أيضا معايرة الملقط البصري المطلق المعاير للقوة لقياسات موضع الخرزة المحاصرة في الموقع باستخدام قياس التداخل BFP بدقة نانومتر51. باستخدام هذا النهج، يمكن ترجمة إشارة الجهد ومستشعر القوة البصرية إلى موضع المسبار المحاصر من خلال المعلمة β [نانومتر/فولت]، في حين أن المعلمة الثابتة α [pN/V] تنتج قيم القوة من خلال معايرة زخم الضوء المذكورة أعلاه41 (انظر أدناه للحصول على التفاصيل).
استكشاف الاخطاء
وجدنا أن التحديات التالية يمكن أن تحدث أثناء التجربة:
لا يتم تشكيل مصيدة مستقرة ويهرب المجهر بسهولة
أي أوساخ على هدف المجهر أو طوق تصحيح منحرف يمكن أن يؤدي إلى فشل فخ مستقر. إذا لم يتم العثور على حل فوري ، فقم بقياس وظيفة انتشار النقطة للعدسة الموضوعية. إذا كانت العينة ذات الاهتمام عميقة داخل نسيج كثيف بصريا ، فقد يواجه تركيز الليزر انحرافات بصرية شديدة تؤدي إلى محاصرة غير مستقرة (عادة ما يكون هذا التأثير ضئيلا في الخلايا المعزولة ولكنه يصبح أكثر وضوحا في الأنسجة السميكة). بالنسبة للصلابة العالية ، يمكن أن تتجاوز قوة استعادة النواة قوة الهروب من المصيدة ، بحيث يتم فقدان المجهر وفشل روتين المسافة البادئة. في البداية ، بالكاد يتم وضع مسافة بادئة لحافة الغشاء النووي القريبة من المصيدة البصرية (الشكل S2A). عندما يحدث هذا ، لم يعد ليزر الاصطياد يتأثر بالقوة والحركة البراونية ، مما يؤدي إلى انخفاض القوة إلى الصفر وانخفاض ضوضاء الإشارة (الشكل S2B). في حالة حدوث ذلك ، يمكن زيادة طاقة الليزر للحصول على مصيدة أقوى ، ويمكن تقليل سعة المسار شبه المنحرف الذي يدفع الخرزة إلى النواة ، أو يمكن وضع الموضع الأولي للميكروبيد المحاصر بعيدا عن النواة.
تتحرك الخلية أثناء التحفيز
إذا لم تكن الخلايا متصلة بما فيه الكفاية ، فإن مصيدة التدرج البصري ستحرك الخلايا أثناء إجراء روتين المسافة البادئة داخل الخلايا ، بحيث تكون القوى والميكانيكا الأساسية للنواة مصطنعة. لمنع إزاحة الخلية بأكملها ، نوصي بزيادة تركيز جزيئات التصاق الخلية على السطح ، على سبيل المثال ، ConA.
تعويض الزخم الأولي
إذا لم يكن روتين تعويض الزخم الأولي متاحا في منصة OTs (الخطوة 6.5) ، فيجب تصحيح إشارة خط الأساس المصطنعة المستقلة عن القوة. هذا مرئي كمنحدر على منحنى القوة حتى مع عدم وجود حبة محاصرة (الشكل S1E). للقيام بالتصحيح ، يجب إجراء نفس المسار بدون خرزة ، خارج الخلية في نفس الموضع بالضبط. لهذا، حرك الخلية بعيدا عن الملائمة باستخدام عنصر تحكم المرحلة. كمرجع ، تتغير قوة الإزاحة 5 pN عبر FOV عند 200 mW في نظامنا ؛ وبالتالي ، يصبح لا يكاد يذكر للمسارات القصيرة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مرحلة مسح بيزو لتحريك الخلايا الموجودة على العينة ، مع ترك موضع الليزر ثابتا.
الخطوات الحاسمة للبروتوكول المقدم
يجب حقن الميكروسفير في المرحلة اليمنى ، 1 خلية لضمان أقصى توزيع على الجنين. لا ينبغي أن تكون الخرز فلورية بحيث لا يتسرب الضوء إلى قنوات الفلورسنت المستخدمة في التصوير. على سبيل المثال ، حتى الخرز الأحمر الفلورسنت النموذجي مرئي بوضوح في القناة الزرقاء المستخدمة لتصوير نواة الخلية بعد تلطيخ Hoechst بسبب سطوعها (الإثارة: 405 نانومتر ؛ الانبعاثات: 445 نانومتر). يعد التعلق المستقر للخلية بالركيزة أمرا بالغ الأهمية لمنع الإزاحة الجانبية أثناء روتين المسافة البادئة. إذا تحركت الخلية أثناء الروتين ، يتم التقليل من شأن القوى. في حالة حدوث ذلك بشكل متكرر ، قم بتحسين بروتوكول المرفق. بالنسبة لخلايا زراعة الأنسجة ، تؤدي بروتينات التصاق الخلايا الأخرى ، مثل الفيبرونيكتين أو الكولاجين أو البولي إل ليسين إلى ارتباط مرض (ملاحظات غير منشورة). أثناء الحبس ، تتعرض الخلايا لإجهاد ميكانيكي مفاجئ وشديد. هذا يمكن أن يسبب تلفا للخلايا وغالبا ما يواجه المجرب خلايا منفجرة إذا لم يتم تنفيذ الإجراء بعناية. أيضا ، إذا كان ارتفاع الحبس صغيرا جدا ، فستعاني جميع الخلايا من كسر المغلف النووي أو تلف لا رجعة فيه. للتخفيف من حدتها، قم بخفض زلة الغطاء العلوية ببطء أكبر و/أو قم بزيادة التباعد بين زلة الغطاء.
قيود التقنية والاقتراحات للتغلب عليها
هناك قيود واضحة على هذه التقنية وهي تغلغل ضوء الليزر في أقسام عميقة من الأنسجة ، مما يؤدي إلى انحرافات ومحاصرة غير مستقرة. وبالتالي ، يعتمد الحد الأدنى لعمق الاختراق على وضوح العينة ، وتصحيح الانحراف الذي يمكن استخدامه73 وقوة الليزر المطبقة. يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن طاقة الليزر الأعلى تؤدي إلى الإثارة الحرارية للعينة بالقرب من المجهر. ومع ذلك ، يتم تقليل تسخين العينة التي نشأت عن بقعة الليزر ذات الطول الموجي 1064 نانومتر لتجنب الإجهاد المعقول المرتبط بالحرارة على عيناتنا البيولوجية74.
قيد آخر هو الحد الأقصى للقوة التي يمكن قياسها. على الرغم من أن الكشف المباشر عن زخم الضوء يمكن من قياس القوة إلى ما هو أبعد من نظام الاستجابة الخطية للمصيدة البصرية40,41 ، فإن القوة القصوى المطبقة هي في حدود بضع مئات من بيكو نيوتن. وهذا محدود بقوة الليزر وما يترتب على ذلك من عتبة الضرر للمواد البيولوجية اللينة والاختلافات في معامل الانكسار، والتي لا تزيد عادة عن 0.1 أو 0.344. وقد اقترحت عدة طرق لزيادة حد الكشف عن القوة، على سبيل المثال، استخدام الضوء المنظم75، والميكروسفير المغلف المضاد للانعكاس76، والجسيمات ذات معامل الانكسار العالي77 أو النقاط الكمومية شديدة المنشطات78.
يمكن استخدام OTs لقياسات موضع النانومتر من خلال قياس التداخل BFP ، بحيث يكون موضع الخرزة داخل المصيدة هو Δx = β Sx ، حيث Sx هي إشارة الجهد للمستشعر ، ويمكن معايرة β [μm / V] أثناء التنقل باتباع بروتوكولات مختلفة35,54. بالنسبة لمستشعر القوة البصرية ، يمكن إثبات أن عامل التحويل الثابت من الجهد إلى القوة α [pN / V] يرتبط مباشرة β وصلابة المصيدة ، k [pN / μm] ، من خلال α = kβ 37) في التجارب مع إزاحات الخرز الصغيرة جدا التي لا يمكن اكتشافها من التصوير البصري ، يمكن استخدام هذه الاستراتيجية لاستكمال قياسات القوة مع الكشف عن موضع صغير. مثال على ذلك هو تطبيق الروتين التجريبي المعروض هنا على نوى شديدة الصلابة ، والتي لا تكفي القوى ذات قوى الليزر المعقولة (200-500 ميجاوات) للحث على قيم المسافة البادئة الكبيرة بما فيه الكفاية. في هذه الحالة ، يجب ملامسة الخرزة للنواة ويجب معايرة صلابة المحاصرة قبل القياس (الخطوة 8.6). يمكن تحديد المسافة البادئة d للنواة كدالة للقوة بشكل غير مباشر على النحو التالي:
d = xtrap – F/k
حيث xtrap هو موضع المصيدة. يختلف العامل β [μm/V] عن عامل زخم الضوء الثابت α [pN/V]، حيث يحتاج إلى معايرة قبل كل تجربة لأنه يعتمد على العديد من المتغيرات المحلية التي تحدد ديناميكيات الملائمة، مثل حجم الجسيمات، وحجم بقعة المصيدة البصرية، ومؤشرات الانكسار النسبية.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تعترف MK بالدعم المالي المقدم من وزارة الاقتصاد والقدرة التنافسية الإسبانية من خلال الخطة الوطنية (PGC2018-097882-A-I00) ، FEDER (EQC2018-005048-P) ، برنامج سيفيرو أوتشوا لمراكز التميز في البحث والتطوير (CEX2019-000910-S; RYC-2016-21062) ، من مؤسسة Privada Cellex ، و Fundació Mir-Puig ، ومن Generalitat de Catalunya من خلال CERCA وبرنامج الأبحاث (2017 SGR 1012) ، بالإضافة إلى التمويل من خلال ERC (MechanoSystems) و HFSP (CDA00023/2018). تعترف V.R. بالدعم المقدم من وزارة العلوم والابتكار الإسبانية لشراكة EMBL ، ومركز Excelencia Severo Ochoa ، وخطة MINECO الوطنية (BFU2017-86296-P ، PID2020-117011GB-I00) و Generalitat de Catalunya (CERCA). تعترف V.V. بالدعم المقدم من برنامج الدكتوراه ICFOstepstone الممول من برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية منحة Marie Skłodowska-Curie 665884. نشكر أرناو فاري على قراءته النقدية للمخطوطة. ماريا مارسال للمساعدة في تصوير وتركيب الجنين 24 hpf و ؛ سيندا خيمينيز-ديلغادو للحصول على الدعم مع الحقن المجهري لسمك الزرد.
Materials
| #1.5 22 mm cover glasses | Ted Pella | 260148 | |
| #1.5 22×60 mm Coverglasses | Ted Pella | 260152 | |
| #1.5H glass bottom dishes | Willco | GWST-5040 | |
| 10-um beads | Supelco | 72986 | |
| 1-mm glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0020 GC100F-15 | |
| 1-um polystyrene microbeads | Sigma | 89904 | |
| 1-um red-fluorescent beads | ThermoFisher | F8816 | |
| Agar | ThermoFisher | 16500500 | |
| Aqcuisition cameras sCMOS | Andor | Sona-4BV11-UNI | |
| Auxiliary camera (Figure 3, AUX) | Blackfly, FLIR | BFS-U3-200S6M-C | |
| Calbryte 520 | AAT Bioquest | 520 AM | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5453000011 | |
| Concanavalin A | Sigma | C5275 | |
| DMEM | Sigma | D2906 | |
| DNA-Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| Double scotch tape | Biesse Adesivi | ||
| E3 | 5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 mM MgSO4 | ||
| Eclipse Ti2 | Nikon | ||
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| GPI-GFP | |||
| H2A-mCh | |||
| Image acquisition software | Fusion-Andor | ||
| Immersion Oil | Cargille | Type B: 16484 | |
| IR protection googles | Thorlabs | LG1 | |
| Lap2b-eGFP | |||
| Micro loader pipette | Eppendorf | GELoader | |
| Microinjector | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| MicroManager 2.0 | |||
| Micromiter slide | ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisions | ||
| Mineral oil | Sigma | M3616 | |
| Motorized stage | ASI | ||
| Needle puller | Sutter instrument Co. | Model P-97 | |
| Optical tweezers platform | Impetux Optics | Sensocell | |
| OTs software (LightAce) | Impetux Optics | ||
| PDMS | Sigma | Sylgard 184 | |
| PDMS Curing agent | Sigma | Sylgard 184 | |
| Post processing software (Matlab) | Mathworks | ||
| RNAse free water | Thermofisher | AM9937 | |
| Short-pass dichroic mirror (Figure 3, IR-F) | Semrock | FF01-950/SP-25 | |
| Spin-coater | Specialty Coating Systems | Spincoat G3P-8 | |
| Spinning-disk confocal microscope | Andor | DragonFly 502 | |
| Stereomicroscope | Leica M80 | ||
| Triangular microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Universal oven | Memmert | UNB 200 | |
| Water immersion objective | Nikon | MRD07602 |
Referencias
- Chan, C. J., Heisenberg, C. P., Hiiragi, T. Coordination of Morphogenesis and Cell-Fate Specification in Development. Current Biology. 27 (18), 1024-1035 (2017).
- Heller, E., Fuchs, E. Tissue patterning and cellular mechanics. Journal of Cell Biology. 211 (2), 219-231 (2015).
- Heisenberg, C. P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
- Petridou, N. I., Spiró, Z., Heisenberg, C. P. Multiscale force sensing in development. Nature Cell Biology. 19 (6), 581-588 (2017).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nature Cell Biology. 10 (4), 429-436 (2008).
- Ruprecht, V., et al. Cortical contractility triggers a stochastic switch to fast amoeboid cell motility. Cell. 160 (4), 673-685 (2015).
- Shellard, A., Mayor, R. Supracellular migration – Beyond collective cell migration. Journal of Cell Science. 132 (8), (2019).
- Mongera, A., et al. A fluid-to-solid jamming transition underlies vertebrate body axis elongation. Nature. 561 (7723), 401-405 (2018).
- Atia, L., et al. Geometric constraints during epithelial jamming. Nature Physics. 14 (6), 613-620 (2018).
- Turlier, H., Maître, J. -. L. Mechanics of tissue compaction. Seminars in Cell & Developmental Biology. 47-48, 110-117 (2015).
- Ladoux, B., Mège, R. M. Mechanobiology of collective cell behaviours. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).
- Venturini, V., et al. The nucleus measures shape changes for cellular proprioception to control dynamic cell behavior. Science. 370 (6514), (2020).
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
- Kirby, T. J., Lammerding, J. Emerging views of the nucleus as a cellular mechanosensor. Nature Cell Biology. 20 (4), 373-381 (2018).
- Lee, H. P., et al. The nuclear piston activates mechanosensitive ion channels to generate cell migration paths in confining microenvironments. Science Advances. 7 (2), (2021).
- Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. Nuclear mechanics during cell migration. Current Opinion in Cell Biology. 23 (1), 55-64 (2011).
- Versaevel, M., Riaz, M., Grevesse, T., Gabriele, S. Cell confinement: Putting the squeeze on the nucleus. Soft Matter. 9 (29), 6665-6676 (2013).
- Zuela-Sopilniak, N., et al. Measuring nucleus mechanics within a living multicellular organism: Physical decoupling and attenuated recovery rate are physiological protective mechanisms of the cell nucleus under high mechanical load. Molecular Biology of the Cell. 31 (17), 1943-1950 (2020).
- Kim, D. H., Wirtz, D. Cytoskeletal tension induces the polarized architecture of the nucleus. Biomaterials. 48, 161-172 (2015).
- Lomakin, A. J., et al. The nucleus acts as a ruler tailoring cell responses to spatial constraints. Science. 370 (6514), (2020).
- Hampoelz, B., et al. Microtubule-induced nuclear envelope fluctuations control chromatin dynamics in Drosophila embryos. Development. 138 (16), 3377-3386 (2011).
- Heo, S. J., et al. Differentiation alters stem cell nuclear architecture, mechanics, and mechano-sensitivity. eLife. 5, 1-21 (2016).
- Cosgrove, B. D., et al. Nuclear envelope wrinkling predicts mesenchymal progenitor cell mechano-response in 2D and 3D microenvironments. Biomaterials. 270, 120662 (2021).
- Liu, H., et al. In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy. ACS Nano. 8 (4), 3821-3828 (2014).
- Hobson, C. M., et al. Correlating nuclear morphology and external force with combined atomic force microscopy and light sheet imaging separates roles of chromatin and lamin A/C in nuclear mechanics. Molecular Biology of the Cell. 31 (16), 1788-1801 (2020).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).
- Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency. Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).
- Davidson, P. M., et al. High-throughput microfluidic micropipette aspiration device to probe time-scale dependent nuclear mechanics in intact cells. Lab on a Chip. 19 (21), 3652-3663 (2019).
- Lombardi, M., Zwerger, M., Lammerding, J. Biophysical assays to probe the mechanical properties of the interphase cell nucleus: Substrate strain application and microneedle manipulation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), (2011).
- Luo, T., Mohan, K., Iglesias, P. A., Robinson, D. N. Molecular mechanisms of cellular mechanosensing. Nature Materials. 12 (11), 1064-1071 (2013).
- Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures. Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature Cell Biology. 16 (4), 376-381 (2014).
- Bustamante, C. J., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nature Reviews Methods Primers. , 1-29 (2021).
- Svoboda, K., Block, S. M. Force and velocity measured for single kinesin molecules. Cell. 77 (5), 773-784 (1994).
- Berg-Sørensen, K., Flyvbjerg, H. Power spectrum analysis for optical tweezers. Review of Scientific Instruments. 75 (3), 594-612 (2004).
- Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Optical-trap force transducer that operates by direct measurement of light momentum. Methods in Enzymology. 361 (1994), 134-162 (2003).
- Farré, A., Montes-Usategui, M. A force detection technique for single-beam optical traps based on direct measurement of light momentum changes. Optics Express. 18 (11), 11955 (2010).
- Català, F., Marsà, F., Montes-Usategui, M., Farré, A., Martín-Badosa, E. Extending calibration-free force measurements to optically-trapped rod-shaped samples. Scientific Reports. 7, 1-10 (2017).
- Bui, A. A. M., et al. Calibration of force detection for arbitrarily shaped particles in optical tweezers. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
- Farré, A., Marsà, F., Montes-Usategui, M. Beyond the hookean spring model: Direct measurement of optical forces through light momentum changes. Methods in Molecular Biology. 1486, (2017).
- Farré, A., Marsà, F., Montes-Usategui, M. Optimized back-focal-plane interferometry directly measures forces of optically trapped particles. Optics Express. 20 (11), 12270 (2012).
- Jun, Y., Tripathy, S. K., Narayanareddy, B. R. J., Mattson-Hoss, M. K., Gross, S. P. Calibration of optical tweezers for in vivo force measurements: How do different approaches compare. Biophysical Journal. 107 (6), 1474-1484 (2014).
- Mas, J., Farré, A., Sancho-Parramon, J., Martín-Badosa, E., Montes-Usategui, M. Force measurements with optical tweezers inside living cells. Optical Trapping and Optical Micromanipulation XI. 9164, (2014).
- Schürmann, M., Scholze, J., Müller, P., Guck, J., Chan, C. J. Cell nuclei have lower refractive index and mass density than cytoplasm. Journal of Biophotonics. 9 (10), 1068-1076 (2016).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), (2009).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. (Danio rerio), 5th Edition. , (2007).
- Schubert, R., et al. Assay for characterizing the recovery of vertebrate cells for adhesion measurements by single-cell force spectroscopy. FEBS Letters. 588 (19), 3639-3648 (2014).
- Koschwanez, J. H., Carlson, R. H., Meldrum, D. R. Thin PDMS films using long spin times or tert-butyl alcohol as a solvent. PLoS One. 4 (2), 2-6 (2009).
- Das, R., et al. Mechanical stretch inhibition sensitizes proprioceptors to compressive stresses. bioRxiv. , (2021).
- Chardès, C., Clement, R., Blanc, O., Lenne, P. F. Probing cell mechanics with bead-free optical tweezers in the drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (141), (2018).
- Staunton, J. R., Blehm, B., Devine, A., Tanner, K. In situ calibration of position detection in an optical trap for active microrheology in viscous materials. Optics Express. 25 (3), 1746 (2017).
- Bola, R., Treptow, D., Marzoa, A., Montes-Usategui, M., Martin-Badosa, E. Acousto-holographic optical tweezers. Optics Letters. 45 (10), 2938-2941 (2020).
- Thalhammer, G., Obmascher, L., Ritsch-Marte, M. Direct measurement of axial optical forces. Optics Express. 23 (5), 6112 (2015).
- Vermeulen, K. C., et al. Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors. Review of Scientific Instruments. 77 (1), 1-6 (2006).
- Dzementsei, A., Barooji, Y. F., Ober, E. A., Oddershede, L. B. Foregut organ progenitors and their niche display distinct viscoelastic properties in vivo during early morphogenesis stages. bioRxiv. , 1-35 (2021).
- Behrndt, M., et al. Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation. Science. 338 (6104), 257-260 (2012).
- Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. , (2018).
- A-Hassan, E., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74 (3), 1564-1578 (1998).
- Khalilgharibi, N., et al. Stress relaxation in epithelial monolayers is controlled by the actomyosin cortex. Nature Physics. 15, (2019).
- Crick, S. L., Yin, F. C. Assessing micromechanical properties of cells with atomic force microscopy: importance of the contact point. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 6 (3), 199-210 (2007).
- Hurst, S., Vos, B. E., Betz, T. Intracellular softening and fluidification reveals a mechanical switch of cytoskeletal material contributions during division. bioRxiv. , 425761 (2021).
- Kaplan, J. L., Bonfanti, A., Kabla, A. RHEOS.jl – A Julia package for rheology data analysis. arXiv. 4, 1-5 (2020).
- Bonfanti, A., Kaplan, J. L., Charras, G., Kabla, A. Fractional viscoelastic models for power-law materials. Soft Matter. 16 (26), 6002-6020 (2020).
- Rivas-Barbosa, R., Escobedo-Sánchez, M. A., Tassieri, M., Laurati, M. i-Rheo: determining the linear viscoelastic moduli of colloidal dispersions from step-stress measurements. Physical Chemistry Chemical Physics: PCCP. 22 (7), 3839-3848 (2020).
- Tassieri, M., et al. i-Rheo: Measuring the materials’ linear viscoelastic properties “in a step”. Journal of Rheology. 60 (4), 649-660 (2016).
- Zhong, M. C., Wei, X. B., Zhou, J. H., Wang, Z. Q., Li, Y. M. Trapping red blood cells in living animals using optical tweezers. Nature Communications. 4, 1767-1768 (2013).
- Harlepp, S., Thalmann, F., Follain, G., Goetz, J. G. Hemodynamic forces can be accurately measured in vivo with optical tweezers. Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3252-3260 (2017).
- Bayoudh, S., Mehta, M., Rubinsztein-Dunlop, H., Heckenberg, N. R., Critchley, C. Micromanipulation of chloroplasts using optical tweezers. Journal of Microscopy. 203 (2), 214-222 (2001).
- Favre-Bulle, I. A., Stilgoe, A. B., Rubinsztein-Dunlop, H., Scott, E. K. Optical trapping of otoliths drives vestibular behaviours in larval zebrafish. Nature Communications. 8 (1), 630 (2017).
- Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (5), 1416-1421 (2015).
- Ferro, V., Chuai, M., McGloin, D., Weijer, C. J. Measurement of junctional tension in epithelial cells at the onset of primitive streak formation in the chick embryo via non-destructive optical manipulation. Development (Cambridge). 147 (3), (2020).
- Hörner, F., et al. Holographic optical tweezers-based in vivo manipulations in zebrafish embryos. Journal of Biophotonics. 10 (11), 1492-1501 (2017).
- Zhong, M. -. C., Wang, Z. -. Q., Li, Y. -. M. Aberration compensation for optical trapping of cells within living mice. Applied Optics. 56 (7), 1972 (2017).
- Català, F., Marsà, F., Montes-Usategui, M., Farré, A., Martín-Badosa, E. Influence of experimental parameters on the laser heating of an optical trap. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Taylor, M. A., Waleed, M., Stilgoe, A. B., Rubinsztein-Dunlop, H., Bowen, W. P. Enhanced optical trapping via structured scattering. Nature Photonics. 9 (10), 669-673 (2015).
- Bormuth, V., et al. Optical trapping of coated microspheres. Optics Express. 16 (18), 13831-13844 (2008).
- Sudhakar, S., et al. Germanium nanospheres for ultraresolution picotensiometry of kinesin motors. Science. 371 (6530), (2021).
- Shan, X., et al. Optical tweezers beyond refractive index mismatch using highly doped upconversion nanoparticles. Nature Nanotechnology. 16 (5), 531-537 (2021).
