Protokollerne beskriver højtydende flydende kromatografi metoder koblet til brydningsindeks eller massespektrometrisk detektion til undersøgelse af metaboliske reaktioner i komplekse lysat-baserede celle-fri systemer.
Engineering cellulære metabolisme til målrettet biosyntese kan kræve omfattende design-build-test-learn (DBTL) cykler som ingeniør arbejder omkring cellens overlevelse krav. Alternativt kan udførelse af DBTL-cyklusser i cellefrie miljøer fremskynde denne proces og afhjælpe bekymringer med værtskompatibilitet. En lovende tilgang til cellefri metabolisk teknik (CFME) udnytter metabolisk aktive råcelleekstrakter som platforme for biofremstilling og til hurtigt at opdage og prototyping modificerede proteiner og veje. Realisering af disse funktioner og optimering af CFME-ydeevne kræver metoder til at karakterisere metabolomet af lysatbaserede cellefrie platforme. Det vil sige, at analytiske værktøjer er nødvendige for at overvåge forbedringer i målrettede metabolitkonverteringer og til at belyse ændringer af metabolitstrøm, når man manipulerer lysatmetabolisme. Her blev metabolitanalyser ved hjælp af højtydende flydende kromatografi (HPLC) kombineret med enten optisk eller massespektrometrisk detektion anvendt til at karakterisere metabolitproduktion og flux i E. coli S30-lysater. Konkret beskriver denne rapport forberedelsen af prøver fra CFME-lysater til HPLC-analyser ved hjælp af brydningsindeksdetektering (RID) for at kvantificere produktionen af centrale metaboliske mellemprodukter og biprodukter i omdannelsen af billige substrater (dvs. glukose) til forskellige produkter af høj værdi. Analysen af metabolitkonvertering i CFME-reaktioner fodret med 13C-mærket glukose gennem omvendt fase flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri (MS / MS), et kraftfuldt værktøj til at karakterisere specifikke metabolit udbytter og lysat metabolisk flux fra udgangsmaterialer, er også præsenteret. Alt i alt gør anvendelsen af disse analysemetoder til CFME lysatmetabolisme det muligt at fremme disse systemer som alternative platforme til udførelse af hurtigere eller nye metaboliske tekniske opgaver.
Begrænsninger i tekniske mikrober til kemisk produktion kan løses ved at generobre biokemiske reaktioner in vitro, hvor konkurrerende cellulære overlevelsesfunktioner er fraværende1. Desuden er det åbne reaktionsmiljø (dvs. fravær af en cellemembran) mere modtageligt for manipulation og er lettere at overvåge sammenlignet med levende celler. Dette grundlæggende koncept for cellefri metabolisk teknik (CFME) er elegant blevet demonstreret ved rekonstitution af metaboliske veje til at syntetisere værdifulde kemikalier som brint og monoterpener med produktionsmålinger, der er størrelsesordener højere end præsenteret i mikrobielle cellefabrikker hidtil1,2,3 . Metoder til rensning af hele veje er imidlertid i øjeblikket begrænset af tid og omkostninger. Alternativt kan cellefrie metaboliske systemer udledes af råcelleekstrakter gennem hurtige og billige metoder i forhold til hele vejen rekonstitution4. Det centrale stofskifte, der opbevares i celleekstrakter, kan suppleres med energisubstrater (f.eks. glukose og enzymatiske cofaktorer) og salte i bufferede opløsninger til at generere centrale metaboliske prækursorer i over 24 timer5,6. Tilsætning af udefrakommende enzymer til den lysatbaserede CFME-reaktion giver mulighed for mere komplekse biotransformationer af glukose til mere værdifulde kemikalier ved høje titere4,6,7. Selvom udbyttet har tendens til at blive kompromitteret i disse systemer på grund af deres cellelignende metaboliske kompleksitet, er der og er ved at blive udviklet unikke metoder til at kuratere lysatproetomer til højere udbyttekonvertering7,8.
Den nemme at udføre metaboliske transformationer i lysatbaserede cellefrie systemer gør disse fremragende platforme til enten at flytte kemisk produktion uden for cellen helt eller til prototype af nye veje med høj gennemløb, før de bygger og tester disse designs in vivo2,9. For enten anvendelse, værktøjer til overvågning metaboliske konverteringer eller observere generelle ændringer til metabolisk flux i lysater er en integreret del af udviklingen af CFME. Højtydende flydende kromatografi (HPLC) kan anvendes til at adskille de kemiske bestanddele af CFME-reaktioner med høj opløsning og kan kobles til optiske eller massespektrometrære detektorer til metabolitkvantificering5,10. Det grundlæggende princip i HPLC er, at analytter opløst i et opløsningsmiddel (dvs. mobil fase) og pumpes gennem en kolonne vil interagere med den specifikke kolonne emballage materiale (dvs. stationær fase)11. Afhængigt af deres kemiske egenskaber udviser disse analytter varierende retentionstider, før de til sidst eluteres fra den stationære fase og bæres af den mobile fase til en detektor. Denne rapport beskriver udarbejdelsen og analysen af E. coli lysate-baserede CFME-reaktioner gennem HPLC-baserede metoder, der udnytter RID og MS/MS-detektion.
HPLC koblet til brydningsindeksdetektering (HPLC-RID) er en generelt tilgængelig metode til hurtigt at identificere centrale metaboliske prækursorer og slutprodukter. Kort sagt måler RID, hvordan analytter ændrer lysafbøjningen i den mobile fase12. RID-signaler svarende til målanaytter i prøver kan derefter kvantificeres ved sammenligninger med RID-signaler fra standardopløsninger. I CFME-programmer har denne detektionsmåde oftest været anvendt med HPLC-kolonner, der adskiller forbindelser baseret på en kombination af størrelsesudelukkelses- og ligandudvekslingsmekanismer eller ion-modereret partitionskromatografi5,6,8,13. Denne særlige teknik bruges til hurtigt at kvantificere forbruget af sukkersubstrater som glukose samt dannelsen af fermenteringsprodukter som succinate, laktat, format, acetat og ethanol i lysatbaserede CFME-reaktioner8. Registrering af koncentrationsændringerne af disse forbindelser via HPLC har været nyttig til både at belyse potentialet i råcelleekstrakter til at samle centrale metaboliske prækursorer og forstå, hvordan vejstrøm omdirigeres gennem fermentative veje under komplekse metaboliske konverteringer fra glukose i lysater6,8,14. Skelsættende CFME-undersøgelser i E. coli-celleekstrakter bekræfter, at fermenteringsforbindelser ophobes som slutprodukter af glukosekatabolisme og også forekommer som uønskede biprodukter i lysater, der overekspresserer eksogene enzymer6,15. Det foreslås, at fermentativ metabolisme spiller en nødvendig rolle i regenerering af redox ækvivalenter af cofaktorer (dvs. NAD (P)H og ATP) til at opretholde glykolytiske reaktioner8. Derfor er en HPLC-baseret optisk detektionsmetode designet til at adskille fermenteringsprodukter et nyttigt og almindeligt anvendt værktøj, når der udføres forskellige lysatbaserede CFME-opgaver.
CFME kan implementeres for at akkumulere metaboliske slutprodukter, der ikke er kulhydrater, organiske syrer eller alkoholer4. Måling af mellemprodukter, der forbruges så hurtigt som de syntetiseres, kan også være ønskeligt10. Mens HPLC-RID er tilgængelig med hensyn til omkostninger og vanskeligheder, er denne metode begrænset af dens evne til kun at skelne metabolitter baseret på opbevaringstid. En bredere vifte af metabolitter kan analyseres, når flydende kromatografi kobles til MS/MS detection (LC-MS/MS)16. Ved denne metode er analytter i den mobile fase ioniseret og differentieret detekteret baseret på hvert molekyles masse- og opladningsegenskaber. Kendskab til både metabolitens masse-til-opladningsforhold (m/z) og opbevaringstid på kolonnen letter således adskillelsen af de fleste metaboliske mellemprodukter og slutprodukter med høj opløsning16. Denne detektionsteknik kan også kobles til nano-flydende kromatografi, som giver meget lavere strømningshastigheder og prøveindsprøjtningsmængder, hvilket giver mulighed for mere følsom påvisning af små molekyler i den komplekse lysatbaggrund17. LC-MS/MS kan desuden anvendes med isotopmærkning, da indbygget etiketter giver ændringer i analytes m/z-værdier18. Timepointmålinger udvundet af en CFME-reaktion suppleret med et 13C6-glukosesubstrat kan således bestemme de slut- eller biprodukter, der er afledt specifikt af suppleret glukose. Selvom denne isotopsporingsmetode endnu ikke anvendes almindeligt i CFME-undersøgelser, er det et effektivt værktøj til at forstå metaboliske konverteringer i lysatbaserede CFME-systemer, specifikt da salttællere (dvs. acetat og glutamat) i disse reaktioner også kataboliseres som sekundære substrater19. Udnyttelse af denne teknik kan således tegne et omfattende billede af glukosemetabolisme i lysater, som den dag i dag ikke er helt forstået. Her beskriver protokollen en metode til nano-flydende kromatografi koblet til nanoelektrosprayionisering (nano ESI) MS/MS, der kan bruges til at afhøre en mulig model for glukosemetabolisme, specielt i E. coli lysater (Figur 1). Modellen er baseret på rapporter om fermentative veje, og pentosephosphatvejen er aktiv i E. coli lysater, der stammer fra stammer, der dyrkes i rige medier5,6,8,14. Teknikken bruges desuden til at undersøge aminosyreproduktion, da den nuværende viden om aminosyre anabolisme fra glukose i lysater er begrænset til et par eksempler såsom syntesen af aromatiske aminosyrer7. I betragtning af den mest polære karakter af slutprodukter og mellemprodukter i disse veje (dvs. organiske syrer, sukkerphosphater og aminosyrer), blev omvendt faset flydende kromatografi udnyttet her. Denne teknik adskiller polarforbindelser ved elution fra en ikkepolær stationær fase. Disse forbindelser blev derefter ioniseret af nano ESI i negativ ion-tilstand, som gør det muligt at detektere analytter med mindst én negativ elementarladning og er derfor nyttig til påvisning af sure forbindelser. Denne teknik anvendes her til at analysere glukose-afledte 13C-indarbejde metabolitter og demonstrerer nytten af LC-MS / MS til forståelse af glukosemetabolisme i lysater.
Den skitserede HPLC-RID-tilgang kan bruges til at kvantificere forbruget af sukkersubstrat og efterfølgende konverteringer til større organiske syre- og alkoholprodukter af lysatcentral metabolisme over tid. Desuden anvender denne protokol en simpel isokratisk metode ved hjælp af en enkelt mobil fase, kræver minimal prøveforberedelse og giver mulighed for en simpel målrettet downstream-analyse. Analytter målt ved HPLC-RID-metoden skelnes udelukkende af deres opbevaringstider og dermed deres interaktioner med den valgte kolonneharpiks. HPLC kolonne anvendes her var specielt designet til at adskille kulhydrater, organiske syrer, og alkoholer ved at kombinere størrelse-udelukkelse og ligand udveksling (dvs. ion-modereret partition kromatografi). Den beskrevne metode er derfor nyttig til mere målrettet analyse af kulhydratsubstrater og udvalgte slutprodukter af glukosefermenteringsveje, som primært forventes at lette og energize lysatebaserede biotransformationer8,15,21. Men, denne protokol ikke tegner sig for aktivering af andre metaboliske veje i celle ekstrakter. Rørledninger, der anvender andre kromatografiske separationsteknikker (dvs. hydrofil interaktionskromatografi), gradient elution metoder, mere kompliceret prøve forberedelse (dvs. derivatisering), og forskellige optiske detektorer (f.eks ultraviolet lys eller fordampningslys spredning detektorer) kunne anvendes til at opdage andre metabolitter såsom aminosyrer og sukker fosfater23,24 . Alternativt kan en global tilgang til undersøgelse af lysatmetabolisme tages ved hjælp af LC-MS/MS.
Den beskrevne LC-MS/MS-metode er en enkelt arbejdsgang til måling og identifikation af en bredere vifte af metabolitter. LC-MS/MS er et topmoderne analyseværktøj til metabolomprofilering på grund af dets følsomhed og evne til at skelne metabolitter efter retentionstid og m/z-nøgletal med høj opløsning16. Med fokus på centrale kulstof metaboliske veje og aminosyre anabolisme, negativ tilstand MS / MS blev gennemført for specifikt at opdage polære organiske syrer, sukker fosfater, og aminosyrer. Kombineret med en nano-flydende kromatografi teknik, metoden giver høj følsomhed til påvisning af små molekyler i den komplekse lysat baggrund17. Med hensyn til profilering af lysatbaseret CFME-metabolisme er en begrænsning af den beskrevne LC-MS/MS-protokol imidlertid dens nedre detektionsgrænse på 50 m/z, hvilket udelukker måling af ethanol, et vigtigt produkt i lysat glucosemetabolisme, samt format, som begge ellers let kvantificeres efter den detaljerede HPLC-RID-metode. Sammenlignet med LC-MS/MS har HPLC-RID den ekstra fordel, at den relative tilgængelighed med hensyn til omkostninger og vanskeligheder. Til sidstnævnte punkt kan fejlfinding af den LC-MS/MS-metode, der er beskrevet her, kræve en vis grad af ekspertise inden for massespektrometri. Ikke desto mindre har MS-detektion unikt tiltalende applikationer over RID, da det desuden kan skelne mærkede isotoper i metabolomer, en fremragende teknik til at forstå kulstofbevægelse fra supplerede substrater gennem det komplekse lysat metaboliske netværk18. En sådan tilgang blev anvendt her ved at supplere reaktioner med 13C6-glukose og analysere de relative overflodsværdier af downstream 13C-inkorporerende metabolitter. Analysen gjorde det muligt at definere aktive og inaktive veje, støtte tidligere rapporterede antagelser og give ny indsigt om metabolisk flux i lysater. Der kan også foretages ændringer inden for metoden til specifikke analyser. For eksempel kan standardopløsninger af 13C-mærkede målforbindelser analyseres sammen med prøver for at opnå absolutte kvantitative målinger af glukose-afledte molekyler over tid og drage konklusioner om fluxfordelinger. Bedre registrering af positivt ladede forbindelser kan også aktiveres i den aktuelle arbejdsproces ved at køre sekvenser med .meth-filer justeret til registrering af positiv tilstand.
Analytisk prøveudtagning i begge beskrevne metoder er bekvemt automatiseret, hvilket sikrer høj reproducerbarhed. Desuden kan der forventes glatte analytiske kørsler, så længe der overholdes korrekt instrumenthåndteringspraksis og vedligeholdelse. Ved brug af disse værktøjer til at analysere CFME-reaktioner bør der tages mere kritiske overvejelser opstrøms og nedstrøms af prøveudtagning. Under prøveforberedelse er det vigtigt, at tidskurskontroller er repræsentative for time-zero. Her blev proteiner udfældet i lysater ved forsuring for at stoppe metaboliske reaktioner. Til tid-nul prøver blev syreopløsningsmidlet kombineret med lysat, før reaktionsmikset indeholdt glukose. Forsuring med trichloreddikesyre sikrede effektivt, at glukose ikke metaboliseres på tid-nul, som vist i HPLC-RID-dataene (Figur 2). Mens en lignende procedure for at slukke glukosemetabolisme blev udført i den rapporterede LC-MS/MS-analyse, blev der påvist 13C-mærkede metabolitter i time-zero-prøver, om end ved betydeligt lave overflodsværdier i forhold til prøver, der blev udvundet på senere tidspunkt. Desuden var disse observationer begrænset til parprodukter af glykolyse. Dataene tyder på, at reaktionerne bevarer en vis grad af glykolytisk aktivitet efter forsuring med ekstraktionsopløsningsmidlet, der detekteres ved denne meget følsomme metode. Omfanget af denne aktivitet bør dog kvantificeres. En tidligere undersøgelse rapporterede , at sure ekstraktionsmidler ikke i tilstrækkelig grad må slukke mellemliggende glykolytiske reaktioner, men kan stoppe et betydeligt glukoseforbrug10. Mens dette stadig skal undersøges yderligere i det system, der anvendes her, drastiske ændringer i relative overflod værdier mellem tid-nul og senere timepoint prøver kan fortolkes som tendenser i glukose metabolisme. Undersøgelse af alternative slukningsmetoder anbefales dog i lignende applikationer, specielt til opnåelse af absolutte mængder metaboliske mellemprodukter10. Desuden bør der også overholdes god praksis i forbindelse med downstream-softwareanalyser. Konsistens er afgørende, når du manuelt integrerer spidsområder fra RID-signaler for at reducere menneskelige fejl. Manuel integration bør også anvendes på spidsbelastningsområder af standarder, når der anvendes manuelt integrerede spidsområder til at kvantificere metabolitkoncentrationer i prøver. I hele den målrettede LC-MS/MS-analyse bør foreløbige anmærkninger fra MZmine-analyse valideres ved manuel topkontrol ved hjælp af en MS-kvalitetsbrowser, og m/z-funktioner bør kun kommenteres, når beregnede massefejl er acceptable. Her blev disse analyser udført manuelt for et begrænset sæt mål, da omfattende og robust software til isotopsøgning endnu ikke er etableret. Men sådanne automatiserede metoder til søgning 13C mærket metabolitter er i øjeblikket ved at opstå og ville strømline mere komplicerede analyser samt, ligesom profilering lysater ud central kulstof metabolisme25.
Avanceret flydende kromatografi er en robust og bredt anvendt metode til adskillelse af små molekyler i komplekse metaboliske blandinger11. De beskrevne metoder parerer denne separationsteknik med brydningsindekset eller massespektrometrisk detektion for at kunne analysere metabolitkonverteringer i lysatbaserede CFME-reaktioner. HPLC-RID og LC-MS/MS er individuelt effektive værktøjer til profilering af aktiv lysatmetabolisme, og deres komplementaritet kan yderligere udnyttes til at håndtere hver tekniks iboende begrænsninger. De rapporterede metoder gør det muligt at anvende og udvikle CFME, da de kan udnyttes til at forstå lysatmetabolisme, overvåge forbedringer i målrettede metabolitkonverteringer og belyse ændringer til metabolitstrøm, når de manipulerer lysatmetabolisme.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev sponsoreret af Genomic Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, som en del af Plant Microbe Interfaces Scientific Focus Area (http://pmi.ornl.gov). Oak Ridge National Laboratory administreres af UT-Battelle, LLC, for det amerikanske energiministerium på kontrakt DE-AC05-00OR22725. Dette manuskript er blevet forfattet af UT-Battelle, LLC i henhold til kontrakt DE-AC05-00OR22725 med det amerikanske energiministerium. Den amerikanske regering bevarer og udgiveren, ved at acceptere artiklen til offentliggørelse, anerkender, at den amerikanske regering bevarer en ikke-klam, betalt, uigenkaldelig, verdensomspændende licens til at offentliggøre eller gengive den offentliggjorte form af dette manuskript, eller tillade andre at gøre det, for usa’s regering formål. Department of Energy vil give offentligheden adgang til disse resultater af føderalt sponsoreret forskning i overensstemmelse med DOE Public Access Plan (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
0.22 μm centrifuge tube filters (spin columns) | Corning Costar | 8160 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
1260 Infinity Binary LC Pump | Agilent | G1312B | HPLC-RID system |
1260 Infinity High Performance Degasser | Agilent | G4225A | HPLC-RID system |
1260 Infinity Refractive Index Detector | Agilent | G7162A | HPLC-RID system |
1260 Infinity Standard Autosampler | Agilent | G1329B | HPLC-RID system |
13C6-glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | CFME reaction mix component (LC-MS/MS) |
500 mL 0.20 μm pore (PES membrane) filter | VWR | 10040-436 | |
Acetonitrile (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A955 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A7699 | CFME reaction mix component |
Aminex HPX 87-H column | Bio-rad | 1250140 | Chromatography column for HPLC-RID |
Ammonium acetate (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A11450 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Ammonium glutamate | Sigma-Aldrich | G1376 | CFME reaction mix component |
Autosampler vial caps (yellow, snap) | Thermo Scientific | C4011-50Y | Sample storage/delivery for LC-MS/MS |
Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene) | Wheaton | W225181 | Sample storage/delivery for LC-MS/MS |
Benchtop microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
Bis-Tris | Sigma-Aldrich | B9754 | CFME reaction mix component |
Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282 | CFME reaction mix component |
D-dextrose (Glucose) | VWR | BDH9230 | CFME reaction mix component |
Dipotassium phosphate | Sigma-Aldrich | P8281 | CFME reaction mix component |
Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Formic acid (LC/MS grade) | Thermo Scientific | 85178 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Fused silica (internal diameter of 100 μm, external diameter of 375 μm) | Polymicro Technologies | WM22005-ND | Chromatography column for LC-MS/MS |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | S30 buffer ingredient |
Isopropanol (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A461 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Kinetex 5 μm C18 stationary phase (100 Å) | Phenomenex | N/A; special order | Chromatography column for LC-MS/MS |
LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | N/A; special order | Mass spectrometer for LC-MS/MS |
Magnesium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | S30 buffer ingredient |
Magnesium glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | CFME reaction mix component |
Methanol (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A456 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
NAD+ | Sigma-Aldrich | N0632 | CFME reaction mix component |
Nanospray Ionization Source | ThermoFisher Scientific/Proxeon | ES071 (newest model) | Mass spectrometer for LC-MS/MS |
OpenLab CDS (Online) Software | Agilent | Version 2.15.26 | Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data |
Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software | Thermo | Version 2.7 | Software for tuning the LC-MS/MS system |
Potassium acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | S30 buffer ingredient |
Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1501 | CFME reaction mix component |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5415 C | |
Screw caps (with septa, 9 mm) | Supelco | 29315-U | Sample storage/delivery for HPLC-RID |
Screwthread glass vials (2 mL) | Supelco | 29376-U | Sample storage/delivery for HPLC-RID |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 241245 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Sodium formate | Sigma-Aldrich | 247596 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Sodium lactate | Sigma-Aldrich | 71716 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Succinic acid | Sigma-Aldrich | 398055 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | Solvent preparation for HPLC-RID |
Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
Tris-acetate | GoldBio | T-090-100 | S30 buffer ingredient |
Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Solvent Rack: SRD-3600 | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
Water (LC/MS grade) | Fisher Scientific | W6500 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Xcalibur Software | Thermo | Version 3.0.63 | Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS |