모세관 전기영동 전기분무 이온화 질량분석법에 의한 이노시톨 피로인산염의 절대 정량

1. CE-ESI-MS 시스템 설정 상용 CE 시스템과 애질런트 제트 스트림(AJS) 전기분무 이온화(ESI) 소스가 장착된 삼중 사중극자 탠덤 질량분석기로 구성된 CE-ESI-MS 시스템을 설정합니다. CE-ESI-MS 분무기 키트와 등용매 LC(액체 크로마토그래피) 펌프가 필요합니다. 외피 흐름 1:100 스플리터(CE-MS 분무기 키트에 포함)와 등용매 LC 펌프 배출구를 연결합니다. CE 시스템 주입 바이알이 질량 분석기의 분무기 팁과 동일한 높이에 있는지 확인하십시오. MassHunter 워크스테이션(버전 10.1) 또는 유사한 MS 소프트웨어를 활용하여 전체 시스템을 제어하고 데이터 수집 및 분석을 수행할 수 있습니다. 2. 완충액, 모세관 및 CE-MS 시스템 준비 CE 실행 완충액 준비: 수산화암모늄으로 40mM 아세트산암모늄의 pH를 9.0으로 조정합니다. 250mL 부피 플라스크를 사용하는 것이 좋습니다. 0.2μm 공극 크기의 멤브레인 필터로 250mL의 버퍼를 여과합니다. 초순수 탈이온수와 MS 등급 시약만 사용하십시오.알림: 이 완충액은 실온에서 2-3주 동안 또는 냉장고에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다. 시스 액체 준비: 250mL 병에 초순수 100mL와 LC-MS 등급 이소프로판올 100mL를 섞습니다. 적어도 일주일에 한 번 외장 액체를 교체하십시오. 고분해능 질량분석기를 사용할 때 외피 액체에 질량 기준을 추가합니다. 외피 액체 설치: 5mL/분으로 5분 동안 퍼지하고 유속을 1mL/분(CE-MS 분무기에 10μL/분)으로 설정합니다. 펌프 압력은 약 180bar입니다. 재활용 튜브가 칼집 액체 병에 다시 연결되어 용매를 재사용하는지 확인하십시오. 모세관 준비: UV 감지 창이 있는 CE-MS 모세관(길이 125cm의 50μm 내경 및 365μM 외경)을 구입하십시오. 사용자는 또한 전문 유통 업체로부터 훨씬 저렴한 바 융합 실리카 모세관을 얻을 수 있습니다. 길이 100cm의 모세관을 자릅니다. 회전하는 다이아몬드 블레이드가있는 모세관 컬럼 커터로 모세관 끝을 올바르게 절단하고 라이터로 양쪽 끝의 2-3cm의 폴리이 미드 코팅을 제거합니다. 이소프로판올로 모세관 표면을 청소하십시오. 모세관 설치: 모세관을 CE-MS 카세트에 맞춥니다. 카세트 변경 버튼을 클릭하고 카세트를 CE 장치에 설치합니다. 모세관의 입구 끝은 전극보다 약 2mm 낮습니다. 주입 과정에서 입구 끝이 샘플 표면보다 낮은지 확인하십시오. 모세관 활성화: 처음 사용하기 전에 모세관을 1M NaOH로 세척한 다음 물을 10분 동안 세척하고 CE 실행 버퍼를 15분 동안 세척합니다. 모세관 끝을 CE-MS 분무기에 삽입: 모세관을 CE-MS 분무기에 부드럽게 넣고 모세관 끝이 분무기 끝에서 약 0.1mm 돌출되도록 합니다. 돋보기와 분무기의 조정 나사로 모세관 배출구 끝을 정밀하게 조정하십시오. 분무기를 이온 소스에 다시 삽입하고 조정 나사를 만지지 마십시오. 이 동작을 수행할 때 MS는 대기 모드에 있다. ESI 스프레이 확인: 전체 스캔 모드에서 ESI 분무기의 안정성을 확인합니다. 총 이온 전기 페로 그램의 변동은 5 % 이내 여야합니다. InsP 표준물질로 테스트 실행 수행: 50mbar에서 10초(10nL) 동안 주입하여 테스트 실행을 위해 2μM InsP3-InsP 8 표준물질(정량적 31PNMR15,27로 조정)의 혼합물을 사용합니다. 표 1과 같이 자세한 ESI 및 MS 파라미터를 설정합니다. CE 전류는 약 26μA입니다. 피크 폭은 약 0.4-0.5 분입니다. 신호 대 잡음비가 400 이상에 도달하는지 확인합니다. 3. 포유류 세포에서 가용성 이노시톨 인산염 추출 참고 : HCT116NIH 세포는 Stephen Shears28의 친절한 선물이었습니다. HCT116UCL 세포는 사이아르디의 실험실26으로부터 나왔다. 세포 파종10% 태아 소 혈청(FBS)이 보충된 둘베코의 변형된 독수리 배지(DMEM) 중 5% 고습도CO2 분위기(표준 조건으로 추가로 지칭됨)에서 37°C의 T75 플라스크에서 HCT116NIH 또는 HCT116UCL 세포를 배양한다. HCT116NIH 및 HCT116UCL 스톡 배양물을 인산완충식염수(PBS)(5mL)로 세척하고, 세포가 완전히 분리될 때까지 표준 조건에서 트립신-에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)(3mL, 0.25%)으로 세포를 배양한다. 배지(7 mL)를 첨가하여 트립신 활성을 켄칭하고, 세포를 원심분리 튜브 및 원심분리기(200 x g, 3분)에 수집한다. 상청액을 제거하고 세포를 배지(10 mL)에 재현탁시킨다. 세포를 세고 트리판 블루 배제를 통해 생존력을 결정합니다. 세포(분석당 600만 HCT116 세포)를 150mm 접시에 넣고 총 20mL의 세포 배양 배지를 조정합니다. 파종하기 전에 원심분리 튜브에서 배지와 세포를 미리 혼합하여 접시에 세포를 균등하게 분배합니다. 셀 번호에 의한 정규화가 필요한 경우 병렬 접시를 준비하십시오. 72 시간 동안 표준 조건에서 세포를 배양하십시오. 세포는 약 80%-90% 합류에 도달합니다. NaF 및 세포 수확을 통한 이노시톨 인산염 수준의 조절NaF 처리 : 배지에 수확하기 1 시간 전에 NaF (10mM)를 첨가하십시오. 플레이트/피펫팅을 소용돌이치며 배지를 혼합하고 표준 조건에서 60분 동안 세포를 배양합니다. NaF 처리 후 세포에서 배지를 제거하고 세포를 얼음 위에 놓습니다. 세포를 PBS(5 mL, 4°C)로 2회 세척하고 PBS를 접시로부터 완전히 제거한다. 과염소산 (PA) (1 mL, 1 M, 4 ° C)을 첨가하십시오. 전체 표면을 PA로 덮으십시오 (단백질이 침전됨에 따라 세포가 흰색으로 변합니다). 세포를 4°C의 틸트 테이블 상에서 10분 동안 인큐베이션한다. PA를 원심분리 튜브에 모으고 원심분리(17,000 x g, 5분, 4°C)로 오염 부스러기를 제거합니다. InsPs의 풀다운을 위해 준비된TiO2 비드에 상청액을 첨가한다. 탈산화를 위해 추출 후 접시를 PBS(5mL, r.t.)로 두 번 세척합니다. 접시에서 PBS를 완전히 제거하십시오. 세포 용해 완충액(1.5 mL, r.t.; 0.1 M NaOH 중 0.1% 나트륨 도데실 설페이트[SDS])의 첨가를 통해 플레이트 상에 단백질을 가용화시킨다. r.t.의 틸트 테이블에서 접시를 15분 동안 배양합니다. 세포 용해물을 원심분리 튜브와 원심분리기(17,000 x g, 5분, 4°C)로 옮깁니다. 소 혈청 알부민을 보정 표준으로 사용하여 DC 단백질 분석을 통해 단백질 농도가 결정될 때까지 상청액을 -80°C에서 보관하십시오(일반적으로 150mm 접시 1개에는 약 10mg의 단백질이 들어 있음). 평행 접시에서 세포 수 결정: 단계 3.1.2에 설명된 대로 트립신을 통해 평행 접시의 세포를 수확하고(150mm 접시에 5mL 트립신-EDTA 사용) 배지를 제거합니다. 세포 펠릿을 PBS(5mL)에 재현탁하고 적절하게 혼합한 다음 세포를 세십시오. 직접 퀀칭을 통해 수확 직전에 이 단계를 수행하여 대표적인 세포 수를 얻으십시오. 또한 적절한 방법(예: 멀티사이저 기계 사용)으로 셀의 부피를 측정합니다. 이노시톨 포스페이트의TiO2 농축참고: 인산화 화합물의 산성 분해를 방지하려면 얼음에서 용리될 때까지 모든 농축 단계를 수행하고 모든 시약을 4°C로 냉각하십시오. 추출 시간을 최소 (1.5-2 시간)로 유지하십시오. 1 M PA로 모든 추출 단계를 수행하십시오.비드의 제조:TiO2 비드(샘플당 5mg)를ddH2O(1mL) 및 원심분리기(3,500 x g, 1분, 4°C)로 세척합니다. ddH2O를 제거하고 비드를 PA(1 mL)로 세척한다. 원심분리(3,500 x g, 1분, 4°C)로 PA를 제거합니다. 비드를 PA(샘플당 50μL)에 재현탁합니다. 인산화 화합물을 함유하는 상청액(비교 섹션 3.2, 단계 3.2.5)을 비드 현탁액, 와류에 첨가한 다음, 샘플을 4°C에서 20분 동안 회전시킨다. 샘플을 원심분리(3,500 x g, 1분, 4°C)하고 상청액을 버린다. 비드를 PA(500μL)와 원심분리기(3,500 x g, 1분, 4°C)로 세척합니다. 상청액을 버리고 세척 단계를 반복한다. NH4OH(200μL, 3%)를 비드에 첨가하고 재현탁시킨다. r.t.에서 샘플을 5분 동안 회전합니다. 샘플을 원심분리하고(3,500 x g, 1분) 상청액을 새 원심분리 튜브로 옮깁니다. 용리 단계 3.3.4 및 3.3.5를 반복하고 용리액을 결합합니다. 구슬을 버리십시오. 혼합된 용리액(17,000 x g, 1분, 4°C)을 원심분리하여 불용성 잔류물을 제거합니다. 상청액을 진공 증발 하에서 완전히 건조시킨다(70분, 60°C, V-AQ). InsPs를 함유하는 건조 추출물에 ddH2O (50 μL)를 첨가한다. 와동시켜 완전히 용해될 때까지 샘플을 혼합한다. 샘플을 CE-ESI-MS 분석이 될 때까지 -20°C에서 보관한다. 4. CE-ESI-MS 실행 수행 40 μM [13 C 6] 1,5- (PP) 2-InsP 4, 80 μM [13 C 6] 5-PP-InsP 5, 80 μM [13 C 6] 1-PP-InsP 5, 400 μM [13 C 6] InsP 6 및 400 μM [13C 6] Ins(1,3,4,5,6) P 5를 포함하는 내부 표준물질의 혼합물을 준비합니다. SIL IS 용액의 농도는 인증된 참조 표준물질(예: 포스포아세트산)의 도움을 받아 정량적 31P및 1HNMR로 측정합니다.참고: 순도가 96%보다 높은 위의 모든 SIL 내부 표준(IS)은 Fiedler 그룹15,27에서 합성 및 제공했습니다. 뉴클레오티드와 마찬가지로 이러한 IS는 많은 결정 물 분자와 다양한 반대 이온을 운반 할 수 있습니다. 물질을 칭량하고 농도를 계산하는 대신 정량적 31PNMR에 의한 13C6표준 용액의 농도 측정이 권장됩니다. CE 샘플 바이알에서 10 μL의 샘플을 0.5 μL의 내부 표준물질 혼합물과 혼합합니다. 2 μM [13 C 6]1,5- (PP) 2-InsP 4, 4 μM [13 C 6] 5-PP-InsP 5, 4 μM [13 C 6] 1-PP-InsP 5, 20 μM [13 C 6] InsP 6 및 20 μM [13C 6] Ins (1,3,4,5,6) P 5는 샘플 내부의 최종 농도입니다. 보충 시스템을 사용할 때 병 교체 버튼을 클릭하고 준비된 250mL의 CE 실행 버퍼를 전해질 병에 넣은 다음 클린 튜브를 클릭합니다. 보충 바늘을 물병에 보관하십시오. 표 1과 같이 ESI 및 MS 파라미터를 설정합니다. 이노시톨 폴리포스페이트 표준물질이 혼합된 Source Optimizer를 사용하여 소스 파라미터를 최적화합니다. 모든 표준물질과 함께 매스헌터 옵티마이저를 사용하여 다중 반응 모니터링(MRM) 설정을 얻습니다. 다른 계측에 대한 ESI 및 MS/MS 설정을 조정합니다. InsP 추출에 대한 실행을 수행하고 결과를 확인합니다(그림 2). 샘플이 더 많은 경우 시퀀스를 설정합니다. 측정 후 MS를 대기 모드로 설정하십시오. LC 펌프를 끄지 마십시오. 외피 액체의 흐름은 분무기 바늘을 보호합니다. 외피 액체 공급이 없을 때 CE-ESI-MS 분무기를 LC-ESI-MS 분무기로 교체하십시오. 5. 데이터 분석 정량 분석(QQQ용) 소프트웨어를 열고 모든 샘플에 대한 배치를 생성합니다. 수집된 MRM 데이터에서 새 메서드를 만듭니다. [13C6]InsP를 내부 표준으로 설정합니다 – (ISTD). MRM 화합물 설정, 머무름 시간 설정, ISTD 설정, 농도 설정 및 한정자 설정을 확인합니다. 유효성 검사를 통과하고 종료하여 현재 일괄 처리에 메서드를 적용합니다. 메서드를 저장합니다. 배치의 각 피크가 제대로 통합되었는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 피크를 수동으로 통합합니다. 결과를 스프레드시트로 내보냅니다. 분석물 피크 반응과 SIL IS의 각 피크 반응을 알려진 농도와 비교하여 이노시톨(파이로)포스페이트의 정량을 수행합니다. 선형 범위의 5-PP-InsP5,InsP6 및 Ins(1,3,4,5,6)P5에 대한 이론 및 실험 교정 곡선은 표 2에 나와 있습니다.참고: 이론적 교정 곡선을 적용하는 전제 조건은 표적화된 분석물의 고품질 동위원소 패턴과 신뢰할 수 있는 농도의 사용입니다. 선형 범위를 평가합니다. 검량선은 위에서 언급한 동위원소 표준물질의 완전한 획득이 비현실적인 경우 절대 정량에 필수적입니다. InsP 추출 용액의 측정 된 농도와 부피로 절대량을 계산하십시오. 또한, 세포 수 또는 단백질 함량에 따라 양을 정상화하십시오. HCT116 (1.68 fL)의 세포 수 및 평균 세포 부피를 기준으로 세포 농도를 계산하십시오.