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Bioquímica

Quantificazione assoluta di inositolo pirofosfati mediante elettroforesi capillare Elettrospray ionizzazione spettrometria di massa

Published: August 13, 2021
doi:
10.3791/62847
, , ,
1Institute of Organic Chemistry,University of Freiburg, 2Medical Research Council, Laboratory for Molecular Cell Biology,University College London

Summary

Viene descritta una procedura per elettroforesi capillare elettrospray ionizzazione spettrometria di massa per la quantificazione assoluta di inositolo pirofosfati da estratti di cellule di mammifero.

Abstract

Inositolo pirofosfati (PP-InsP) sono un importante gruppo di molecole di segnalazione intracellulare. Derivate da fosfati di inositolo (InsP), queste molecole presentano la presenza di almeno una porzione di pirofosfato energetico sull’anello myo-inositolo. Esistono ovunque negli eucarioti e operano come messaggeri metabolici che esaminano l’omeostasi del fosfato, la sensibilità all’insulina e la carica energetica cellulare. A causa dell’assenza di un cromoforo in questi metaboliti, di una densità di carica molto elevata e di una bassa abbondanza, la loro analisi richiede un tracciante radioattivo, e quindi è contorta e costosa. Qui, lo studio presenta un protocollo dettagliato per eseguire la quantificazione assoluta e ad alto rendimento di pirofosfati di inositolo da cellule di mammifero mediante elettroforesi capillare elettrospray ionizzazione spettrometria di massa (CE-ESI-MS). Questo metodo consente la profilazione sensibile di tutte le specie di PP-InsP biologicamente rilevanti nelle cellule di mammifero, consentendo la separazione basale dei regioisomeri. Vengono presentate le concentrazioni cellulari assolute di PP-InsP, inclusi gli isomeri minori, e il monitoraggio dei loro cambiamenti temporali nelle cellule HCT116 in diverse condizioni sperimentali.

Introduction

Dalla scoperta iniziale dei pirofosfati di mio-inositolo (PP-InsPs) nel 19931,2, sono stati compiuti progressi significativi per chiarire la loro biosintesi, fatturato e funzioni3. I pirofosfati di inositolo si trovano ubiquitariamente nelle cellule eucariotiche4 e servono come molecole di segnalazione metabolica criticamente coinvolte, ad esempio, omeostasi del fosfato 5,6, sensibilità all’insulina7, oscillazioni del calcio8,9, traffico vescicolare 10, apoptosi 11, riparazione del DNA 12, segnalazione immunitaria 13 e altri. La pletora di processi importanti sotto il controllo di inositolo pirofosfati richiede una comprensione più profonda della loro abbondanza cellulare, fluttuazione, e localizzazione.

Sebbene InsP e PP-InsP abbiano attirato l’attenzione in tutte le discipline, l’analisi della loro abbondanza viene eseguita di routine utilizzando un metodo sviluppato durante gli anni ’80, consistente nella marcatura delle cellule con inositolo triziato, risolvendo i PP-InsP estratti mediante cromatografia a scambio anionico forte Sax-HPLC con successivo conteggio a scintillazione. I metodi più recenti basati sulla spettrometria di massa devono ancora affrontare sfide significative: i pirofosfati di inositolo con fino a otto unità di fosfato ospitano esteri fosfatici e anidridi, portando a una carica negativa significativa e potenziale perdita di fosfato durante la ionizzazione. Ci sono quattro tipi principali di PP-InsP trovati nei mammiferi (Figura 1): 1,5-(PP)2-InsP 4 (o 1,5-InsP8), 5-PP-InsP 5 (o 5-InsP 7), 1-PP-InsP 5 (o 1-InsP7) e 5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4 (o5-PP-InsP 4)3,14. I livelli fisiologici di PP-InsP sono tipicamente nell’intervallo da nano a basso micromolare, con 5-PP-InsP 5 come il più abbondante con concentrazioni cellulari di 0,5 – 5 μM. 1,5-(PP) 2-InsP 4 e 1-PP-InsP 5 sono ritenuti fino a circa il 10% del pool 5-PP-InsP5 e rimangono difficili da rintracciare in molte cellule15. 5-PP-InsP4 con un gruppo OH libero è ancora più basso in abbondanza e di solito diventa rilevabile solo quando le idrolasi fosfato sono inibite con fluoruro di sodio (NaF)16.

L’elevata densità di carica dei PP-InsP rende difficile la loro separazione e la presenza di regiomiomi PP-InsP complica ulteriormente questi sforzi. Di conseguenza, la maggior parte degli esperimenti si basava sulla quantificazione mediante marcatura radioattiva metabolica delle cellule usando [3H]-inositolo, poiché lo sfondo dalla matrice è escluso e l’alta sensibilità è raggiunta17,18. Tuttavia, questo metodo è costoso, richiede tempo e non consente di distinguere correttamente i regioisomeri PP-InsP correlati. Inoltre, [3H]-inositolo etichettatura non tiene conto della sintesi endogena di inositolo dal glucosio. Un metodo basato sull’elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) è un’alternativa economica ampiamente applicata, ma limitata nella sua sensibilità 19,20,21,22. Sono stati pubblicati altri approcci che evitano la radiomarcatura, tra cui la cromatografia ionica seguita dalla derivatizzazione post-colonna UV-detection23, la cromatografia di interazione idrofila (HILIC)24 o lo scambio anionico debole (WAX) accoppiato con spettrometria di massa (MS)25. Tuttavia, non sono (ancora) alla pari con il classico protocollo [3H]-inositolo SAX-HPLC.

Recentemente, la spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray per elettroforesi capillare (CE-ESI-MS) è stata introdotta come strategia trasformativa per l’analisi del metabolismo di InsP e PP-InsPs, soddisfacendo tutti i requisiti discussi sopra16. In combinazione con l’attuale estrazione di InsP all’avanguardia mediante acido perclorico seguita da arricchimento con perle di biossido di titanio26, CE-ESI-MS ha avuto successo in ogni organismo testato finora, dal lievito alle piante e ai mammiferi. La profilazione simultanea di InsP e PP-InsP, compresi tutti i possibili regioisomeri, è stata facilmente raggiunta. Gli standard interni stabili marcati con isotopi (SIL) hanno consentito una quantificazione assoluta rapida e precisa, indipendentemente dagli effetti della matrice. Poiché la SM può catturare le differenze di massa isotopica, CE-ESI-MS può anche essere applicato per studiare le vie di sintesi cellulare compartimentate di InsPs e PP-InsP, ad esempio, alimentando le cellule con [13 C 6]-mio-inositolo o [13C6]-D-glucosio.

Qui è descritto un protocollo dettagliato passo-passo per la quantificazione assoluta di PP-InsP e InsP da cellule di mammifero mediante CE-ESI-MS. Oltre al principale isomero 5-PP-InsP 5, in questo studio sono quantificati anche 1,5-(PP)2-InsP4 e 1-PP-InsP5, nonostante la loro minore abbondanza. Vengono studiate due linee cellulari HCT116 provenienti da diversi laboratori (NIH, UCL) ed è convalidato che le cellule HCT116UCL contengono livelli 7 volte superiori di 1,5-(PP)2-InsP 4 rispetto a quelli trovati in HCT116NIH, mentre le concentrazioni di 5-PP-InsP5 sono comparabili. Inoltre, la sintesi di 1-PP-InsP5 in HCT116UCL non è significativamente aumentata. Inoltre, l’aumento dei livelli di PP-InsP bloccando la loro defosforilazione con fluoruro di sodio viene studiato quantitativamente.

Protocol

1. Impostazione del sistema CE-ESI-MS Impostare un sistema CE-ESI-MS costituito da un sistema CE commerciale – e uno spettrometro di massa tandem a triplo quadrupolo, dotato di una sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) Agilent Jet Stream (AJS). Sono necessari un kit spruzzatore CE-ESI-MS e una pompa isocratica LC (cromatografia liquida). Collegare lo splitter di flusso della guaina 1:100 (incluso nel kit spruzzatore CE-MS) e l’uscita della pompa LC isocratica. Assicurarsi che il flaconcino di ingresso del sistema CE sia alla stessa altezza della punta dello spruzzatore dell’analizzatore di massa. Utilizzare MassHunter Workstation (Versione 10.1) o software MS simile per controllare l’intero sistema e per l’acquisizione e l’analisi dei dati. 2. Preparazione del sistema tampone, capillare e CE-MS Preparare il tampone di corsa CE: regolare il pH di 40 mM di acetato di ammonio a 9,0 con idrossido di ammonio. Si raccomanda un matraccio tarato da 250 ml. Filtrare i 250 ml di tampone con filtri a membrana da 0,2 μm di dimensioni poro. Assicurarsi di utilizzare solo acqua deionizzata ultrapura e reagenti di grado MS.NOTA: Questo tampone può essere conservato a temperatura ambiente per 2-3 settimane o per diversi mesi in frigorifero. Preparare il liquido della guaina: mescolare 100 ml di acqua ultrapura e 100 ml di isopropanolo di grado LC-MS in un flacone da 250 ml. Cambiare il liquido della guaina almeno una volta alla settimana. Aggiungere il riferimento di massa nel liquido della guaina quando si utilizza uno spettrometro di massa ad alta risoluzione. Installare il liquido della guaina: spurgare a 5 ml/min per 5 minuti e impostare la portata a 1 mL/min (10 μL/min nello spruzzatore CE-MS). La pressione della pompa sarà di circa 180 bar. Assicurarsi che il tubo di riciclo si ricolleghi alla bottiglia del liquido della guaina per riutilizzare il solvente. Preparare il capillare: acquistare un capillare CE-MS (50 μm i.d. e 365 μM o.d. con una lunghezza di 125 cm) con una finestra di rilevamento UV. L’utente può anche ottenere capillari di silice fusa a barra molto più economici da distributori specializzati. Tagliare un capillare con una lunghezza di 100 cm. Tagliare correttamente entrambe le estremità capillari con un tagliacolonne capillari con un disco diamantato rotante e rimuovere 2-3 cm di rivestimento in poliimmide su entrambe le estremità con un accendino. Pulire la superficie capillare con isopropanolo. Installa capillare: abbina il capillare nella cassetta CE-MS. Fare clic sul pulsante Cambia cassetta e installare la cassetta nel dispositivo CE. L’estremità di ingresso del capillare è circa 2 mm più bassa dell’elettrodo. Assicurarsi che l’estremità di ingresso sia più bassa della superficie del campione durante il processo di iniezione. Attivare il capillare: prima del primo utilizzo, lavare il capillare con 1 M NaOH, seguito da acqua per 10 minuti e tampone CE per 15 minuti. Inserire l’estremità capillare nello spruzzatore CE-MS: inserire delicatamente il capillare nello spruzzatore CE-MS e assicurarsi che l’estremità capillare sporga di circa 0,1 mm dalla punta dello spruzzatore. Assicurarsi di effettuare una regolazione precisa dell’estremità di uscita capillare con una lente d’ingrandimento e la vite di regolazione nello spruzzatore. Inserire nuovamente lo spruzzatore nella sorgente di ioni ed evitare di toccare la vite di regolazione. L’MS è in modalità standby quando si esegue questa operazione. Controlla spray ESI: controlla la stabilità dello spruzzatore ESI in modalità di scansione completa. La fluttuazione degli elettroferogrammi ionici totali deve essere entro il 5%. Eseguire un test con gli standard InsP: utilizzare una miscela di standard InsP3-InsP 8 da 2 μM (regolati da NMR15,27 quantitativi 31P) per le prove con un’iniezione a 50 mbar per 10 s (10 nL). Impostare i parametri ESI e MS dettagliati come mostrato nella Tabella 1. La corrente CE è di circa 26 μA. La larghezza del picco è di circa 0,4-0,5 min. Assicurarsi che il rapporto segnale/rumore raggiunga almeno 400. 3. Estrazione di fosfati solubili di inositolo da cellule di mammifero NOTA: le celluleNIH HCT116 sono state un gentile regalo di Stephen Shears28. Le celluleUCL HCT116 provenivano dal Lab26 di Saiardi. Celle di seminaColtura di cellule HCT116NIH o HCT116UCL in palloni T75 a 37 °C in atmosfera di CO2 ad alta umidità del 5% (di seguito denominate condizioni standard) nel terreno di coltura con aquila modificata (DMEM) di Dulbecco integrato con siero bovino fetale (FBS) al 10%. Lavare le colture madre HCT116NIH e HCT116UCL con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) (5 ml) e incubare le cellule con acido tripsin-etilendiammina tetraacetico (EDTA) (3 ml, 0,25%) in condizioni standard fino a completo distacco. Spegnere l’attività della tripsina aggiungendo mezzo (7 ml), raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga e centrifugare (200 x g, 3 min). Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in mezzo (10 ml). Contare le cellule e determinare la vitalità tramite l’esclusione del blu tripano. Seminare le cellule (6 milioni di cellule HCT116 per test) in un piatto da 150 mm e regolare 20 ml di terreno di coltura cellulare in totale. Premiscelare il terreno e le cellule in una provetta da centrifuga prima della semina per ottenere una distribuzione uniforme delle celle nel piatto. Preparare un piatto parallelo quando è richiesta la normalizzazione per numero di celle. Coltivare le cellule in condizioni standard per 72 ore. Le cellule raggiungeranno circa l’80% -90% di confluenza. Modulazione dei livelli di inositolo fosfato con NaF e raccolta cellulareTrattamento NaF: aggiungere NaF (10 mM) 1 ora prima della raccolta nel substrato. Mescolare il mezzo ruotando la piastra/pipettaggio e incubare le cellule per 60 minuti in condizioni standard. Dopo il trattamento NaF, rimuovere il mezzo dalle cellule e posizionare le cellule sul ghiaccio. Lavare le celle due volte con PBS (5 ml, 4 °C) e rimuovere completamente il PBS dal piatto. Aggiungere acido perclorico (PA) (1 mL, 1 M, 4 °C). Assicurarsi di coprire l’intera superficie con PA (le cellule diventeranno bianche quando le proteine precipitano). Incubare le cellule per 10 minuti su un tavolo inclinabile a 4 °C. Raccogliere il PA in una provetta da centrifuga e rimuovere i detriti contaminanti mediante centrifugazione (17.000 x g, 5 min, 4 °C). Aggiungi il surnatante alle perline TiO2 preparate per il pulldown di InsP. Lavare il piatto post-estrazione due volte con PBS (5 ml, t.r.) per la disacidificazione; rimuovere completamente PBS dal piatto. Solubilizzare le proteine sulla piastra mediante l’aggiunta di tampone di lisi cellulare (1,5 ml, r.t.; 0,1% di sodio dodecilsolfato [SDS] in 0,1 M NaOH). Incubare il piatto per 15 minuti su un tavolo inclinabile a r.t. Trasferire il lisato cellulare in una provetta da centrifuga e centrifugare (17.000 x g, 5 min, 4 °C). Conservare il surnatante a -80 °C fino a determinare la concentrazione proteica mediante il test della proteina DC utilizzando l’albumina sierica bovina come standard di calibrazione (di solito, un piatto da 150 mm contiene circa 10 mg di proteine). Determinazione del numero di cellule da piastre parallele: prelevare le cellule della piastra parallela tramite tripsina come descritto al punto 3.1.2 (utilizzare 5 mL di tripsina-EDTA per il piatto da 150 mm) e rimuovere il terreno. Risospendere il pellet cellulare in PBS (5 ml), mescolare correttamente e contare le cellule. Eseguire questo passaggio subito prima della raccolta tramite tempra diretta per ottenere conteggi cellulari rappresentativi. Inoltre, misurare il volume delle celle con un metodo appropriato (ad esempio, con una macchina multidimensionatore). TiO2 arricchimento dei fosfati di inositoloNOTA: Per evitare la decomposizione acida dei composti fosforilati, eseguire tutte le fasi di arricchimento fino all’eluizione su ghiaccio e raffreddare tutti i reagenti a 4 °C. Mantenere il tempo per l’estrazione al minimo (1,5-2 h). Eseguire tutte le fasi di estrazione con 1 M PA.Preparazione delle perle: lavare TiO 2 perle (5 mg per campione) con ddH2 O (1mL) e centrifugare (3.500 x g, 1 min, 4 °C). Rimuovere ddH2O e lavare le perline con PA (1 mL). Rimuovere PA mediante centrifugazione (3.500 x g, 1 min, 4 °C). Risospendere le perle in PA (50 μL per campione). Aggiungere il surnatante contenente composti fosforilati (confrontare paragrafo 3.2, punto 3.2.5) alla sospensione del tallone, al vortice, quindi ruotare il campione per 20 minuti a 4 °C. Centrifugare il campione (3.500 x g, 1 min, 4 °C) ed eliminare il surnatante. Lavare le perline con PA (500 μL) e centrifugare (3.500 x g, 1 min, 4 °C). Scartare il surnatante e ripetere la fase di lavaggio. Aggiungere NH4OH (200 μL, 3%) alle perline e risospendere. Ruotare il campione per 5 minuti a r.t. Centrifugare il campione (3.500 x g, 1 min) e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Ripetere le fasi di eluizione 3.3.4 e 3.3.5 e combinare gli eluenti. Scartare le perline. Centrifugare gli eluenti combinati (17.000 x g, 1 min, 4 °C) per rimuovere eventuali residui insolubili. Asciugare completamente il surnatante sotto vuoto per evaporazione (70 min, 60 °C, V-AQ). Aggiungere ddH2O (50 μL) agli estratti secchi contenenti InsP. Vortice per mescolare il campione fino a completa dissoluzione. Conservare il campione a -20 °C fino all’analisi CE-ESI-MS. 4. Esecuzione delle esecuzioni CE-ESI-MS Preparare una miscela di standard interni contenenti 40 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4, 80 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5, 80 μM [13 C 6]1-PP-InsP 5, 400 μM [13 C 6]InsP 6 e 400 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5. Determinare le concentrazioni di soluzioni SIL IS mediante NMR quantitativa 31P e 1H, con l’ausilio di uno standard di riferimento certificato, ovvero l’acido fosfoacetico.NOTA: Tutti gli standard interni SIL (IS) di cui sopra con purezze superiori al 96% sono stati sintetizzati e forniti dal gruppo Fiedler15,27. Come con i nucleotidi, questi IS potrebbero trasportare molte molecole di acqua cristallina e diversi controioni. Invece di pesare la sostanza e calcolare la concentrazione, si raccomanda la determinazione della concentrazione di 13C6 soluzioni standard mediante NMR quantitativo 31P. Mescolare 10 μL del campione con 0,5 μL di miscela standard interna in un flaconcino di campione CE. 2 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4, 4 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5, 4 μM [13 C 6]1-PP-InsP 5, 20 μM [13 C 6]InsP 6 e 20 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5 sono le concentrazioni finali all’interno dei campioni. Quando si utilizza il sistema di rifornimento, fare clic sul pulsante Cambia bottiglia, inserire i 250 ml di tampone corrente CE preparati nella bottiglia di elettrolita e fare clic su Clean Tubes. Tenere l’ago di rifornimento in un flaconcino d’acqua. Impostare i parametri ESI e MS come mostrato nella Tabella 1. Ottimizzare i parametri di origine utilizzando un Source Optimizer con una miscela di standard di inositolo polifosfato. Ottieni le impostazioni di monitoraggio delle reazioni multiple (MRM) utilizzando Masshunter Optimizer con tutti gli standard. Regolare le impostazioni ESI e MS/MS per strumentazione diversa. Eseguire un’esecuzione per le estrazioni InsP e controllare il risultato (Figura 2). Impostare una sequenza quando sono presenti più campioni. Lasciare che l’MS sia in modalità standby dopo le misurazioni. Non spegnere la pompa LC. Il flusso di liquido della guaina protegge l’ago dello spruzzatore. Sostituire lo spruzzatore CE-ESI-MS con uno spruzzatore LC-ESI-MS quando non c’è alimentazione di liquido della guaina. 5. Analisi dei dati Aprire il software di analisi quantitativa (per QQQ), creare un batch per tutti i campioni. Creare un nuovo metodo dai dati di gestione record di messaggistica acquisiti. Impostare i [13C6]InsP come standard interni – (ISTD). Controllare l’impostazione del composto MRM, l’impostazione del tempo di ritenzione, l’impostazione dell’ISTD, l’impostazione della concentrazione e l’impostazione del qualificatore. Passare la convalida e uscire per applicare il metodo al batch corrente. Salvare il metodo. Verificare se ogni picco del batch è correttamente integrato; In caso contrario, integrare manualmente il picco. Esporta i risultati in un foglio di calcolo. Eseguire la quantificazione di inositolo (piro)fosfati confrontando la risposta di picco dell’analita con la rispettiva risposta di picco di SIL IS con concentrazioni note. Le curve di calibrazione teoriche e sperimentali sono mostrate nella Tabella 2 per 5-PP-InsP 5, InsP6 e Ins(1,3,4,5,6)P5 con l’intervallo lineare.NOTA: La condizione preliminare che applica la curva di calibrazione teorica è l’uso di un modello isotopico di alta qualità di analiti mirati e con concentrazione credibile. Valutare l’intervallo lineare. Una curva di calibrazione è essenziale per la quantificazione assoluta quando l’acquisizione completa degli standard isotopici sopra menzionati non è pratica. Con la concentrazione misurata nella soluzione di estratto InsP e il suo volume, calcolare le quantità assolute. Inoltre, normalizzare la quantità in base alla conta cellulare o al contenuto proteico. Calcolare la concentrazione cellulare in base alla conta cellulare e al volume cellulare medio di HCT116 (1,68 fL).

Representative Results

I risultati qui riportati mirano a illustrare il potenziale dell’analisi CE-ESI-MS. Le cifre riportate sono descrittive di una corsa CE-ESI-MS tecnicamente impeccabile. In primo luogo, viene presentata una miscela di standard di inositolo pirofosfato (Figura 1) e un estratto di cellule di mammifero (Figura 2). In secondo luogo, viene fornito un confronto tra due linee cellulari HCT116 (Figura 3) e cellule HCT116 trattate con NaF (Figura 4). Gli elettroferogrammi ionici estratti (EIE) degli standard di inositolo (piro)fosfato ad una concentrazione di 2 μM sono mostrati nella Figura 1. Viene inserito il metabolismo dei pirofosfati di inositolo nei mammiferi con le loro strutture semplificate. I quattro pirofosfati di inositolo nei mammiferi, 1,5-(PP)2-InsP 4, 5-PP-InsP 5, 1-PP-InsP 5, e5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 sono ben distinti usando il metodo descritto. Una serie CE-ESI-MS di HCT116UCL è illustrata nella Figura 2. Con l’aiuto di standard interni marcati con isotopi stabili (SIL), una quantificazione assoluta può essere facilmente ottenuta confrontando la risposta del segnale con il SIL spiked-in di concentrazione nota. Vengono visualizzati gli EIE integrati del fosfato di inositolo da InsP5 a (PP) 2-InsP 4 e gli EIE non integrati dei loro modelli isotopici. Gli RSD di tutti gli analiti di sei ripetizioni tecniche sono entro il 4%. Con la concentrazione misurata e il volume degli estratti, è possibile calcolare la quantità di analiti. Con la conta cellulare e il volume cellulare, o contenuto proteico, la concentrazione cellulare assoluta (μM) o la quantità normalizzata dal contenuto proteico (pmol / mg di proteine) sono comunemente i risultati finali di tale analisi. Secondo uno studio precedente, due lotti di cellule HCT116 divergenti hanno una variazione dei livelli di InsP 8, le cellule HCT116UCL contengono livelli 6 volte superiori di InsP8 rispetto alle cellule HCT116NIH 29. Con il metodo CE-MS, 1,5-(PP)2-InsP 4 in HCT116 NIH potrebbe essere facilmente quantificato (Figura 3), e le cellule HCT116UCL contengono livelli 7 volte superiori di InsP8 rispetto a HCT116NIH. Inoltre, un accumulo significativo di 1,5-(PP)2-InsP 4 nelle cellule HCT116UCL è parallelo a un aumento significativo di 1-PP-InsP5, che è ora mostrato quantitativamente nella Figura 3. I livelli di PP-InsPs aumentano inibendo la loro defosforilazione con fluoruro di sodio. L’analisi CE-ESI-MS delle cellule HCT116NIH trattate con NaF ha dimostrato l’elevazione di -5-PP-InsP 5 insieme a una riduzione di InsP 6 e una comparsa di 5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4 (Figura 4). Inoltre, l’elevazione dei livelli di InsP8 è evidente, mentre 1-PP-InsP5 diminuisce in una certa misura. 1-PP-InsP5 non è completamente assente in HCT116NIH trattato con NaF, ma per lo più sotto il limite di rilevazione o quantificazione. Figura 1: Tipici elettroferogrammi ionici estratti (EIE) degli standard di inositolo (piro)fosfato nell’analisi CE-ESI-MS utilizzando il protocollo descritto. La concentrazione di ciascun analita è di 2 μM. Il volume del campione iniettato è di circa 10 nL con un’iniezione a 50 mbar per 10 s. Gli inserti mostrano il metabolismo dei pirofosfati di inositolo nei mammiferi. IPPK: inositolo pentakisphosphate 2-chinasi, IP6K: inositolo esakisfosfato chinasi, PPIP5K: difosfoinositolo pentakisfosfato chinasi, DIPP1: difosfoinositolo polifosfato fosfoidrolasi 1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 2: Profilo rappresentativo InsP delle cellule HCT116 UCL. (A) EIE dei principali inositolo (piro)fosfati in HCT116 NIH e SIL ISs a spillo 2 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4 (1), 4 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5 (2), 4 μM [13 C 6]1-PP-InsP5 (3), 20 μM [13C 6]InsP 6 (4), e 20 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5 (5). Gli inserti mostrano sei ripetizioni tecniche dell’analisi InsP mediante CE-ESI-MS, i dati sono presentati come mezzi ± SD. (B) Concentrazione cellulare di PP-InsPs e InsPs nelle linee cellulari umane HCT116UCL e (C) PP-InsPs e InsPs quantità normalizzata dal contenuto proteico. I dati sono mezzi ± SEM da tre esperimenti indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 3: Variazione dei livelli di InsP8 tra due cellule HCT116 divergenti. (A) EIE di inositolo pirofosfato in HCT116 UCL e HCT116NIH. InsP8 in HCT116UCL è marcatamente più abbondante che in HCT116NIH. (B) Rapporto tra inositolo pirofosfato e InsP6 (%) in entrambe le cellule HCT116. Le cellule HCT116UCL contengono livelli 7 volte superiori di InsP8 rispetto a HCT116NIH, mentre i livelli 5-PP-InsP5 sono uguali. I dati sono mezzi ± SEM da tre esperimenti indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 4: Livelli di inositolo (piro)fosfato nelle cellule HCT116NIH, con trattamento NaF. (A) EIE di inositolo (piro)fosfato in HCT116NIH con trattamento con fluoruro di sodio (NaF, 10 mM). I livelli di inositolo pirofosfato tra cui 1,5-(PP) 2-InsP 4, 5-PP-InsP 5, e 5-PP-Ins (1,3,4,6) P 4 aumentano bloccando la loro defosforilazione usando NaF. (B) Livelli di inositolo (piro) fosfato (le quantità sono normalizzate dal contenuto proteico) nelle cellule HCT116NIH non trattate e trattate con NaF. I dati sono mezzi ± SEM da tre esperimenti indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Tabella 1: impostazioni dei parametri CE-ESI-MS. I parametri Source e iFunnel sono ottimizzati da Source e iFunnel Optimizer. Le impostazioni dei parametri MSM per inositolo (piro) fosfati sono ottimizzate da MassHunter Optimizer. Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella 2: Equazione di regressione teorica e sperimentale. La concentrazione di [13 C 6]5-PP-InsP 5 [13 C 6]InsP 6 e [13C 6]Ins (1, 3, 4, 5, 6)P5 è rispettivamente di 4 μM, 20 μM e 20 μM. Per l’equazione di regressione, la concentrazione di 5-PP-InsP 5 è a 0,04 μM, 0,1 μM, 0,2 μM, 0,4 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 24 μM. La concentrazione di InsP 6 e Ins (1, 3, 4, 5,6)P 5 è a 0,2 μM, 0,5 μM, 1 μM, 2 μM,5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 120 μM. x è la concentrazione, y è (Area InsP)12C/(Area InsP)13C. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussion

Presentato qui è un metodo pratico e sensibile per la quantificazione di pirofosfati inositolo altamente caricato in cellule di mammifero. Combinando questo approccio di analisi con l’attuale estrazione InsP all’avanguardia con acido perclorico seguita da arricchimento con TiO2, l’analisi CE-ESI-MS presenta vantaggi senza precedenti. Per quanto riguarda il suo throughput, sensibilità, stabilità, quantificazione assoluta, identificazione degli isomeri e indipendenza dalla matrice, questo metodo si distingue rispetto ad altri approcci. Questo protocollo è applicabile alle cellule di mammifero, ma in effetti questa strategia ha successo in molti campioni diversi (ad esempio, lievito, piante, parassiti, tessuti di topo, ecc.).

Il protocollo di estrazione applicato recupera completamente PP-InsPs e InsP6 dagli estratti di cellule di mammifero16,19. Estrarrà anche molti altri metaboliti anionici, in particolare specie contenenti fosfati, ad esempio fosfati di zucchero e nucleotidi. Sarebbe necessaria una valutazione del recupero e della decomposizione per gli analiti dell’utente con questo protocollo.

Generalmente, il sistema CE-ESI-MS funziona senza intoppi e può ospitare circa 200 campioni ogni settimana utilizzando questo protocollo. A differenza dell’HPLC, tuttavia, la CE è stata considerata per lungo tempo un metodo per esperti e persone specializzate, il che ne ha limitato il mercato e ne ha limitato l’applicazione. Pertanto, un dispositivo CE-ESI-MS è solitamente assente nelle facoltà analitiche. Le persone che desiderano eseguire analisi CE-ESI-MS probabilmente non hanno esperienza CE e dedicheranno più tempo alla risoluzione dei problemi. Qui vengono evidenziati i passaggi critici. Prima di tutto è la qualità del taglio capillare. La sensibilità e la stabilità dello spray ESI si basano principalmente su un taglio capillare di prima classe. In secondo luogo, l’estremità di uscita capillare dovrebbe essere esattamente 0,1 mm dalla punta dello spruzzatore. L’ago dello spruzzatore e il capillare CE devono essere nella direzione assiale. La qualità dello spray ESI è fondamentale per la quantificazione; Le esecuzioni tecniche dovrebbero essere eseguite per valutare la ripetibilità.

Con il protocollo descritto, il limite di quantificazione (LOQ) per PP-InsPs è 40 nM con un’iniezione a 50 mbar per 10 s (10 nL). Esistono diversi approcci per aumentare ulteriormente la sensibilità del metodo. In primo luogo, un’iniezione a 100 mbar per 20 s (40 nL) si tradurrà comunque in una buona forma di picco e in una risoluzione sufficiente per i regiisomeri 5-PP-InsP 5 e 1-PP-InsP5. In secondo luogo, gli estratti di InsP possono essere sciolti in una minore quantità di acqua. In terzo luogo, il tempo di permanenza potrebbe essere aumentato quando si utilizzano meno transizioni MRM per la quantificazione. Inoltre, una sorgente di ioni CE-MS che utilizza un flusso di liquido con guaina ultra-bassa aumenterebbe significativamente la sensibilità.

Il buffer di corsa CE con pH 9 fornisce la migliore risoluzione tra InsP6-InsP 8. Quando si aumenta il pH a 9,7, la risoluzione tra InsP3-InsP 6 migliorerà significativamente. Grazie all’eccellente risoluzione, si consiglia una lunghezza capillare più corta di 72 cm per aumentare ulteriormente la produttività. Inoltre, una temperatura della cassetta CE più elevata a 40 °C diminuisce la viscosità del tampone elettroforetico acquoso e accelera il loro movimento sotto EOF. In base alle diverse esigenze di ricerca, le modifiche di questo metodo possono facilitare ulteriormente l’analisi di InsP e PP-InsP. Pertanto, i protocolli CE-ESI-MS descritti hanno il potenziale di aprire nuove strade di ricerca in questa famiglia sfaccettata di molecole di segnalazione.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell’ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell’Unione europea (accordo di sovvenzione n. 864246, a HJJ). DQ riconosce il sostegno finanziario del programma Brigitte-Schlieben-Lange. AS è supportato dalla sovvenzione del programma MRC MR/T028904/1.

Materials

Materials
1.5 mL microcentrifuge tubes Greiner Bio-One 616201 –
15 cm tissue culture dishes Thermo Fisher 168381 –
2.0 mL microcentrifuge tubes Greiner Bio-One 623201 –
50 mL centrifuge tubes Greiner Bio-One 227261 –
96-well plates Thermo Fisher 260836 for the DC protein assay
CE fused silica capillary CS Chromatographie 105180 50 µM i.d. 360 µM o.d.
Pipette tips Starlab I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700 10 mL, 1000 µL, 200 µL, 10 µL pipette tips
Serological pipets TPP 94550, 94525, 94010, 94005 50 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL serological pipettes
T75 flasks TPP 90076 –
Chemicals and Reagents
NaOH AppliChem A6829,0500 sodium hydroxide pellets for molecular biology, for preparation of cell lysis buffer
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200056 –
Ammonium acetate Thermo Fisher 1677373 HPLC grade
BSA Thermo Fisher 23209 albumin standard (2.0 mg/mL) for standard curve preparation
DC protein assay Biorad 5000116 DC protein assay reagents package
DMEM Gibco 41966029 high glucose, pyruvate
FBS Gibco 10270106, 10500064 (heat inactivated) 10270106 for HCT116UCL, 10500064 for HCT116NIH
Isopropanol Carl Roth AE73.2 99.95% LC-MS grade
NH4OH, 10% Carl Roth 6756.1 for preparation of 3% NH4OH
PBS Gibco 10010015 –
Perchloric acid, 70% Carl Roth 9216.1 for preparation of 1 M perchloric acid
SDS SERVA 20760.02 for preparation of cell lysis buffer
Sodium fluoride Sigma Aldrich S7920 –
TiO2 beads GL Sciences 5020-75000 5 µm particle size
Trypan blue solution Gibco 15250061 trypan blue stain (0.4%)
Ultrapure (Type 1) water Milli-Q ZRQSVP3WW model: Direct-Q 3 UV Water Purification System
Equipment
Analytical balance Mettler Toledo 30105893 model: XPE26; for weighing of beads (5-6 mg per sample)
Automated cell counter Logos Biosystems L40002 model: LUNA-II Automated Cell Counter
Benchtop centrifuge Hettich 1401 model: UNIVERSAL 320
Benchtop centrifuge with cooling VWR 521-1647P model: Microstar 17R
CE system Agilent G7100A –
CE/MS Adapter Kit Agilent G1603A –
CE/MS Sprayer Kit Agilent G1607A –
Cell counting slides Logos Biosystems L12001 LUNA Cell Counting Slides
Centrifugal evaporator Eppendorf 5305000304 model: Concentrator plus complete system
ESI source Agilent AJS ESI –
Humidified incubator Binder 9040-0088 model: CB E6.1, for cultivation of mammalian cells
Ice box – – should provide enough space for samples, dishes, etc.
Isocratic LC system Agilent G7110B 1260 Iso Pump model: Infinity II Quaternary system
MSD Agilent G6495C triple quadrupole
Multiplate reader Tecan 30086375 model: SPARK 10 M
Pipette filler Thermo Fisher 10072332 for serological pipettes
Pipettes Brand 705884, 705880, 705878, 705872, 705870 various pipettes
Rotator Labnet H5500 model: Mini LabRoller Rotator
Shortix capillary column cutter SGT S0020 –
Test tube shaker (vortex mixer) Carl Roth HXH6.1 model: Rotilabo-Mini Vortex
Tilt table Labnet S0600 model: EDURO MiniMix Nutating Mixer
Water bath Thermo Fisher FSGPD05 model: Isotemp GPD 05
Software
MassHunter Workstation Agilent Version 10.1 –
MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition Agilent Version 10.1 –
MassHunter Workstation Optimizer Agilent Version 10.1 –
MassHunter Workstation Qualitative Analysis Agilent Version 10.0 –
QQQ Quantitaion Analysis Agilent Version 10.1 –
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Stephens, L., et al. The detection, purification, structural characterization, and metabolism of diphosphoinositol pentakisphosphate(s) and bisdiphosphoinositol tetrakisphosphate(s). The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 4009-4015 (1993).
  2. Menniti, F. S., Miller, R. N., Putney, J. W., Shears, S. B. Turnover of inositol polyphosphate pyrophosphates in pancreatoma cells. The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 3850-3856 (1993).
  3. Shears, S. B. Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates. Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).
  4. Irvine, R. F., Schell, M. J. Back in the water: the return of the inositol phosphates. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (5), 327-338 (2001).
  5. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  6. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  7. Chakraborty, A., et al. Inositol pyrophosphates inhibit Akt signaling, thereby regulating insulin sensitivity and weight gain. Cell. 143 (6), 897-910 (2010).
  8. Bittner, T., et al. Photolysis of caged inositol pyrophosphate InsP8 directly modulates intracellular Ca2+ oscillations and controls C2AB domain localization. Journal of the American Chemical Society. 142 (24), (2020).
  9. Hauke, S., et al. Photolysis of cell-permeant caged inositol pyrophosphates controls oscillations of cytosolic calcium in a β-cell line. Chemical Science. 10 (9), 2687-2692 (2019).
  10. Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14206-14211 (2002).
  11. Koldobskiy, M. A., et al. p53-mediated apoptosis requires inositol hexakisphosphate kinase-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (49), 20947 (2010).
  12. Rao, F., et al. Inositol hexakisphosphate kinase-1 mediates assembly/disassembly of the CRL4-signalosome complex to regulate DNA repair and cell death. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16005 (2014).
  13. Williams, S. P., Gillaspy, G. E., Perera, I. Y. Biosynthesis and possible functions of inositol pyrophosphates in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 67 (2015).
  14. Wilson, M. S. C., Livermore, T. M., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates: between signalling and metabolism. The Biochemical Journal. 452 (3), 369-379 (2013).
  15. Harmel, R. K., et al. Harnessing 13C-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR. Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).
  16. Qiu, D., et al. Analysis of inositol phosphate metabolism by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nature Communications. 11 (1), 6035 (2020).
  17. Azevedo, C., Saiardi, A. Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast. Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).
  18. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of radioactive labelling to elucidate inositol polyphosphate signalling. Phosphate Labeling and Sensing in Chemical Biology. , 67-87 (2017).
  19. Wilson, M. S. C., Bulley, S. J., Pisani, F., Irvine, R. F., Saiardi, A. A novel method for the purification of inositol phosphates from biological samples reveals that no phytate is present in human plasma or urine. Open Biology. 5 (3), 150014 (2015).
  20. Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis. PloS One. 4 (5), 5580 (2009).
  21. Dong, J., et al. Inositol pyrophosphate InsP8 acts as an intracellular phosphate signal in arabidopsis. Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).
  22. Riemer, E., et al. ITPK1 is an InsP6/ADP phosphotransferase that controls systemic phosphate homeostasis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2020).
  23. Whitfield, H., et al. An ATP-responsive metabolic cassette comprised of inositol tris/tetrakisphosphate kinase 1 (ITPK1) and inositol pentakisphosphate 2-kinase (IPK1) buffers diphosphosphoinositol phosphate levels. The Biochemical Journal. 477 (14), 2621-2638 (2020).
  24. Ito, M., et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. Journal of chromatography. A. 1573, 87-97 (2018).
  25. Mantilla, B. S., Amaral, L. D. D., Jessen, H. J., Docampo, R. the inositol pyrophosphate biosynthetic pathway of Trypanosoma cruzi. ACS Chemical Biology. 16 (2), 283-292 (2021).
  26. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Inositol phosphates purification using titanium dioxide beads. Bio-Protocol. 8 (15), 2959 (2018).
  27. Puschmann, R., Harmel, R. K., Fiedler, D. Scalable chemoenzymatic synthesis of inositol pyrophosphates. Bioquímica. 58 (38), 3927-3932 (2019).
  28. Gu, C., et al. KO of 5-InsP7 kinase activity transforms the HCT116 colon cancer cell line into a hypermetabolic, growth-inhibited phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 11968-11973 (2017).
  29. Gu, C., Wilson, M. S. C., Jessen, H. J., Saiardi, A., Shears, S. B. Inositol Pyrophosphate Profiling of Two HCT116 Cell Lines Uncovers Variation in InsP8 Levels. PloS One. 11 (10), 0165286 (2016).

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Qiu, D., Eisenbeis, V. B., Saiardi, A., Jessen, H. J. Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (174), e62847, doi:10.3791/62847 (2021).
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