JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

الكمية المطلقة للإينوزيتول بيروفوسفات بواسطة الرحلان الكهربائي الشعري الكهربائي قياس الطيف الكتلي للتأين

Published: August 13, 2021
doi:
10.3791/62847
, , ,
1Institute of Organic Chemistry,University of Freiburg, 2Medical Research Council, Laboratory for Molecular Cell Biology,University College London

Summary

تم وصف إجراء لقياس الطيف الكتلي للتأين الكهربائي بالشعيرات الدموية من أجل الكمية المطلقة لإينوزيتول بيروفوسفات من مستخلصات خلايا الثدييات.

Abstract

اينوزيتول بيروفوسفات (PP-InsPs) هي مجموعة مهمة من جزيئات الإشارات داخل الخلايا. مشتقة من فوسفات الإينوزيتول (InsPs), هذه الجزيئات ميزة وجود واحد على الأقل moiety بيروفوسفات نشط على حلقة ميو-اينوزيتول. وهي موجودة في كل مكان في حقيقيات النوى وتعمل كرسائل أيضية تقوم بمسح توازن الفوسفات وحساسية الأنسولين وشحنة الطاقة الخلوية. نظرا لعدم وجود كروموفور في هذه المستقلبات ، وكثافة شحنة عالية جدا ، ووفرة منخفضة ، فإن تحليلها يتطلب التتبع الإشعاعي ، وبالتالي فهو معقد ومكلف. هنا ، تقدم الدراسة بروتوكولا مفصلا لإجراء كمية مطلقة وعالية الإنتاجية لبيروفوسفات الإينوزيتول من خلايا الثدييات عن طريق قياس الطيف الكتلي للتأين الكهربائي الكهربائي الشعري (CE-ESI-MS). تتيح هذه الطريقة التنميط الحساس لجميع أنواع PP-InsPs ذات الصلة بيولوجيا في خلايا الثدييات ، مما يتيح الفصل الأساسي للأيزومرات regioisomers. يتم عرض التركيزات الخلوية المطلقة ل PP-InsPs ، بما في ذلك الأيزومرات الثانوية ، ومراقبة التغيرات الزمنية في خلايا HCT116 في ظل العديد من الظروف التجريبية.

Introduction

منذ الاكتشاف الأولي لبيروفوسفات ميو-اينوسيتول (PP-InsPs) في 1993 1,2, تم إحراز تقدم كبير لتوضيح التخليق الحيوي, دوران, ووظائف3. تحدث إينوزيتول بيروفوسفات في كل مكان في الخلايا حقيقية النواة4 وتعمل كجزيئات إشارات استقلابية تشارك بشكل حاسم في ، على سبيل المثال ، توازن الفوسفات5,6 ، حساسية الأنسولين7 ، تذبذبات الكالسيوم 8,9 ، الاتجار الحويصلي 10 ، موت الخلايا المبرمج 11 ، إصلاح الحمض النووي 12 ، الإشارات المناعية 13 ، وغيرها. عدد كبير من العمليات الهامة تحت سيطرة بيروفوسفات الإينوزيتول يدعو إلى فهم أعمق لوفرة الخلوية, تقلب, وتوطين.

على الرغم من أن InsPs و PP-InsPs جذبت الانتباه عبر التخصصات ، إلا أن تحليل وفرتها يتم إجراؤه بشكل روتيني باستخدام طريقة تم تطويرها خلال ’80s ، والتي تتكون من وضع العلامات على الخلايا مع الإينوزيتول tritiated ، وحل PP-InsPs المستخرجة بواسطة كروماتوغرافيا تبادل الأنيون القوية Sax-HPLC مع عد التلألؤ اللاحق. لا تزال الطرق الأحدث القائمة على قياس الطيف الكتلي تواجه تحديات كبيرة: إينوزيتول بيروفوسفات مع ما يصل إلى ثماني وحدات فوسفات تؤوي استرات الفوسفات والأنهيدريد ، مما يؤدي إلى شحنة سالبة كبيرة وفقدان محتمل للفوسفات أثناء التأين. هناك أربعة أنواع رئيسية من PP-InsPs الموجودة في الثدييات (الشكل 1): 1،5- (PP) 2-InsP 4 (أو 1،5-InsP8) ، 5-PP-InsP 5 (أو 5-InsP 7) ، 1-PP-InsP 5 (أو 1-InsP7) ، و 5-PP-Ins(1،3،4،6) P 4 (أو5-PP-InsP 4) 3،14. عادة ما تكون المستويات الفسيولوجية ل PP-InsPs في نطاق نانو إلى ميكرومولار منخفض ، مع 5-PP-InsP 5 باعتباره الأكثر وفرة بتركيزات خلوية من 0.5 – 5 ميكرومتر. يعتقد أن 1،5- (PP) 2-InsP 4 و 1-PP-InsP 5 تصل إلى حوالي 10٪ من تجمع 5-PP-InsP5 ولا يزال من الصعب تتبعها في العديد من الخلايا15. 5-PP-InsP4 مع مجموعة OH الحرة أقل وفرة وعادة ما يصبح قابلا للاكتشاف فقط عندما يتم تثبيط هيدرولاز الفوسفات بفلوريد الصوديوم (NaF)16.

تجعل كثافة الشحن العالية ل PP-InsPs فصلها صعبا ، كما أن حدوث أجهزة إعادة تصنيف PP-InsP يزيد من تعقيد هذه الجهود. نتيجة لذلك ، اعتمدت معظم التجارب على القياس الكمي عن طريق وضع العلامات الإشعاعية الأيضية للخلايا باستخدام [3H] -inositol ، حيث يتم استبعاد الخلفية من المصفوفة ويتم تحقيق حساسية عالية17,18. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة مكلفة وتستغرق وقتا طويلا ولا تسمح بالتمييز بشكل صحيح بين عمليات إزالة الأيزومرات PP-InsP ذات الصلة. وعلاوة على ذلك, [3H]-وضع العلامات الإينوزيتول لا يفسر تخليق الإينوزيتول الذاتية من الجلوكوز. الطريقة القائمة على الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد (PAGE) هي بديل غير مكلف يتم تطبيقه على نطاق واسع ولكنه محدود في حساسيته19،20،21،22. تم نشر طرق أخرى لتجنب وضع العلامات الإشعاعية ، بما في ذلك اللوني الأيوني متبوعا بالكشف عن الأشعة فوق البنفسجية بعد اشتقاق العمود23 ، كروماتوغرافيا التفاعل المحبة للماء (HILIC)24 ، أو تبادل الأنيون الضعيف (WAX) إلى جانب قياس الطيف الكتلي (MS)25. ومع ذلك, فهي ليست (حتى الآن) على قدم المساواة مع بروتوكول [3H] الكلاسيكي – الإينوزيتول SAX-HPLC.

في الآونة الأخيرة ، تم تقديم قياس الطيف الكتلي للتأين الكهربائي بالرحلان الكهربائي الشعري (CE-ESI-MS) كاستراتيجية تحويلية لتحليل استقلاب InsPs و PP-InsPs ، مما يلبي جميع المتطلبات التي تمت مناقشتها أعلاه16. جنبا إلى جنب مع استخراج InsP الحالي من بين الفن بواسطة حمض البيركلوريك تليها التخصيب مع حبات ثاني أكسيد التيتانيوم26 ، نجحت CE-ESI-MS في كل كائن حي تم اختباره حتى الآن ، من الخميرة إلى النباتات والثدييات. تم تحقيق التنميط المتزامن ل InsPs و PP-InsPs ، بما في ذلك جميع regioisomers الممكنة. مكنت المعايير الداخلية الموسومة بالنظائر المستقرة (SIL) من إجراء كمية مطلقة سريعة ودقيقة ، بغض النظر عن تأثيرات المصفوفة. نظرا لأن مرض التصلب العصبي المتعدد يمكنه التقاط اختلافات الكتلة النظيرية ، يمكن أيضا تطبيق CE-ESI-MS لدراسة مسارات التخليق الخلوي المجزأة ل InsPs و PP-InsPs ، على سبيل المثال ، عن طريق تغذية الخلايا ب [13 C 6] -myo-inositol أو [13C6] -D-glucose.

الموصوف هنا هو بروتوكول مفصل خطوة بخطوة للقياس الكمي المطلق ل PP-InsPs و InsPs من خلايا الثدييات بواسطة CE-ESI-MS. بصرف النظر عن الأيزومر الرئيسي 5-PP-InsP 5 ، تم أيضا تحديد كمية 1،5- (PP) 2-InsP 4 و 1-PP-InsP5 في هذه الدراسة ، على الرغم من انخفاض وفرتها. تمت دراسة خطين من خلايا HCT116 من مختبرات مختلفة (NIH ، UCL) ، وتم التحقق من أن خلايا HCT116UCL تحتوي على مستويات أعلى بمقدار 7 أضعاف من 1,5- (PP) 2-InsP 4 مما هو موجود في HCT116NIH ، في حين أن تركيزات 5-PP-InsP5 قابلة للمقارنة. بالإضافة إلى ذلك ، لم يتم زيادة توليف 1-PP-InsP5 في HCT116UCL بشكل كبير. أيضا ، تتم دراسة زيادة مستويات PP-InsP عن طريق منع إزالة الفسفرة باستخدام فلوريد الصوديوم كميا.

Protocol

1. إعداد نظام CE-ESI-MS قم بإعداد نظام CE-ESI-MS يتكون من نظام CE تجاري – ومطياف كتلة ترادفي ثلاثي رباعي الأقطاب ، مجهز بمصدر تأين بالرش الكهربائي Agilent Jet Stream (AJS). يلزم وجود مجموعة بخاخ CE-ESI-MS ومضخة LC متساوية (كروماتوغرافيا سائلة). قم بتوصيل مقسم تدفق الغمد 1: 100 (مضمن في مجموعة البخاخ CE-MS) ومخرج مضخة LC متساوي القراطية. تأكد من أن قارورة مدخل نظام CE في نفس ارتفاع طرف البخاخ لمحلل الكتلة. استخدم محطة عمل MassHunter (الإصدار 10.1) أو برنامج MS المماثل للتحكم في النظام بأكمله ، وللحصول على البيانات وتحليلها. 2. إعداد نظام العازلة والشعيرات الدموية ونظام CE-MS تحضير المخزن المؤقت لتشغيل CE: اضبط الرقم الهيدروجيني ل 40 mM من أسيتات الأمونيوم إلى 9.0 مع هيدروكسيد الأمونيوم. يوصى باستخدام دورق حجمي سعة 250 مل. قم بتصفية 250 مل من المخزن المؤقت باستخدام مرشحات غشائية بحجم المسام 0.2 ميكرومتر. تأكد من استخدام الماء منزوع الأيونات فائق النقاء والكواشف من الدرجة MS فقط.ملاحظة: يمكن حفظ هذا المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 أسابيع أو لعدة أشهر في الثلاجة. تحضير سائل الغمد: امزج 100 مل من الماء فائق النقاء و 100 مل من الأيزوبروبانول بدرجة LC-MS في زجاجة سعة 250 مل. تغيير السائل غمد مرة واحدة على الأقل في الأسبوع. أضف مرجع الكتلة إلى سائل الغلاف عند استخدام مطياف كتلة عالي الدقة. قم بتركيب سائل الغمد: قم بالتطهير عند 5 مل / دقيقة لمدة 5 دقائق واضبط معدل التدفق على 1 مل / دقيقة (10 ميكرولتر / دقيقة في بخاخ CE-MS). سيكون ضغط المضخة عند حوالي 180 بار. تأكد من أن أنبوب إعادة التدوير يتصل مرة أخرى بزجاجة السائل الغمد لإعادة استخدام المذيب. تحضير الشعيرات الدموية: قم بشراء شعيرات CE-MS (50 ميكرومتر معرف و 365 ميكرومتر بطول 125 سم) مع نافذة للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية. يمكن للمستخدم أيضا الحصول على شعيرات السيليكا المنصهرة أرخص بكثير من الموزعين المتخصصين. قطع الشعيرات الدموية بطول 100 سم. قم بقص كلا الطرفين الشعريين بشكل صحيح باستخدام قاطع عمود شعري بشفرة ماسية دوارة وإزالة 2-3 سم من طلاء البوليميد على كلا الطرفين بأخف وزنا. تنظيف سطح الشعيرات الدموية مع الأيزوبروبانول. تثبيت الشعيرات الدموية: قم بمطابقة الشعيرات الدموية في علبة CE-MS. انقر فوق الزر “تغيير الكاسيت ” وقم بتثبيت الكاسيت في جهاز CE. نهاية مدخل الشعيرات الدموية أقل بحوالي 2 مم من القطب. تأكد من أن طرف المدخل أقل من سطح العينة أثناء عملية الحقن. تنشيط الشعيرات الدموية: قبل الاستخدام الأول ، اغسل الشعيرات الدموية ب 1 M NaOH ، متبوعا بالماء لمدة 10 دقائق ، والمخزن المؤقت لتشغيل CE لمدة 15 دقيقة. أدخل الطرف الشعري في بخاخ CE-MS: ضع الشعيرات الدموية برفق في بخاخ CE-MS وتأكد من أن الطرف الشعري يبرز حوالي 0.1 مم من طرف البخاخ. تأكد من إجراء ضبط دقيق لنهاية مخرج الشعيرات الدموية باستخدام عدسة مكبرة وبرغي الضبط في البخاخ. أدخل البخاخ مرة أخرى في مصدر الأيونات وتجنب لمس برغي الضبط. MS في وضع الاستعداد عند إجراء هذه العملية. تحقق من رذاذ ESI: تحقق من ثبات بخاخ ESI في وضع المسح الكامل. يجب أن يكون تذبذب إجمالي الأيون الكهربائي في حدود 5٪. قم بإجراء اختبار تشغيل باستخدام معايير InsP: استخدم مزيجا من معايير InsP 3-InsP8 2 ميكرومتر (معدلة بواسطة 31P NMR 15,27) لإجراء اختبار مع حقن عند 50 ملي بار لمدة 10 ثوان (10 نانولتر). قم بتعيين معلمات ESI و MS التفصيلية كما هو موضح في الجدول 1. تيار CE هو حوالي 26 μA. عرض الذروة حوالي 0.4-0.5 دقيقة. تأكد من أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء تصل إلى 400 على الأقل. 3. استخراج فوسفات الإينوزيتول القابل للذوبان من خلايا الثدييات ملاحظة: كانت خلايا HCT116NIH هدية لطيفة من ستيفن شيرز28. كانت خلايا HCT116UCL من مختبر Saiardi26. خلايا البذرثقافة خلايا HCT116NIH أو HCT116UCL في قوارير T75 عند 37 درجة مئوية في جو CO2 عالي الرطوبة بنسبة 5٪ (يشار إليه أيضا بالظروف القياسية) في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS). اغسل مزارع مخزون HCT116NIH و HCT116UCL بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (5 مل) واحتضان الخلايا بحمض رباعي الخليك التربسين-إيثيلين ديامين (EDTA) (3 مل ، 0.25٪) في ظل الظروف القياسية حتى يتم فصلها تماما. إخماد نشاط التربسين بإضافة وسيط (7 مل) ، وجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي ، وأجهزة طرد مركزي (200 × جم ، 3 دقائق). قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في الوسط (10 مل). عد الخلايا وحدد صلاحيتها عن طريق استبعاد تريبان الأزرق. بذر الخلايا (6 ملايين خلية HCT116 لكل فحص) في طبق 150 مم واضبط 20 مل من وسط زراعة الخلايا في المجموع. قم بخلط الوسط والخلايا في أنبوب الطرد المركزي قبل البذر لتحقيق توزيع متساو للخلايا في الطبق. قم بإعداد طبق مواز عند الحاجة إلى التطبيع حسب رقم الخلية. ثقافة الخلايا في ظل ظروف قياسية لمدة 72 ساعة. ستصل الخلايا إلى حوالي 80٪ -90٪ التقاء. تعديل مستويات فوسفات الإينوزيتول مع NaF وحصاد الخلاياعلاج NaF: أضف NaF (10 mM) 1 ساعة قبل الحصاد في الوسط. امزج الوسط عن طريق تحريك اللوحة / الماصة واحتضان الخلايا لمدة 60 دقيقة في ظل الظروف القياسية. بعد علاج NaF ، قم بإزالة الوسط من الخلايا ووضع الخلايا على الجليد. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS (5 مل ، 4 درجات مئوية) وأزل PBS تماما من الطبق. أضف حمض البيركلوريك (PA) (1 مل ، 1 م ، 4 درجة مئوية). تأكد من تغطية السطح بالكامل ب PA (ستتحول الخلايا إلى اللون الأبيض مع ترسب البروتينات). احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق على طاولة مائلة عند 4 درجات مئوية. اجمع PA في أنبوب طرد مركزي وقم بإزالة الحطام الملوث عن طريق الطرد المركزي (17000 × جم ، 5 دقائق ، 4 درجات مئوية). أضف الطافت إلى حبات TiO2 المعدة لسحب InsPs. اغسل طبق ما بعد الاستخراج مرتين باستخدام PBS (5 مل ، ر.ت.) لإزالة الحموضة ؛ إزالة PBS تماما من الطبق. إذابة البروتينات الموجودة على الصفيحة عن طريق إضافة محلول تحلل الخلية (1.5 مل ، r.t. ؛ 0.1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم [SDS] في 0.1 M NaOH). احتضان الطبق لمدة 15 دقيقة على طاولة مائلة في r.t. نقل محللة الخلية إلى أنبوب طرد مركزي وأجهزة طرد مركزي (17000 × جم ، 5 دقائق ، 4 درجات مئوية). قم بتخزين المادة الطافية عند -80 درجة مئوية حتى يتم تحديد تركيز البروتين عن طريق فحص بروتين DC باستخدام ألبومين مصل الأبقار كمعيار معايرة (عادة ، يحتوي طبق واحد 150 مم على حوالي 10 مجم من البروتينات). تحديد أعداد الخلايا من الأطباق المتوازية: احصد خلايا الطبق المتوازي عبر التربسين كما هو موضح في الخطوة 3.1.2 (استخدم 5 مل من التربسين-EDTA للطبق 150 مم) وقم بإزالة الوسط. أعد تعليق حبيبات الخلية في PBS (5 مل) ، واخلطها بشكل صحيح ، وعد الخلايا. نفذ هذه الخطوة قبل الحصاد مباشرة عن طريق التبريد المباشر للحصول على عدد الخلايا التمثيلي. بالإضافة إلى ذلك ، قم بقياس حجم الخلايا بطريقة مناسبة (على سبيل المثال ، باستخدام آلة متعددة الحجم). TiO2 تخصيب فوسفات الإينوزيتولملاحظة: لتجنب التحلل الحمضي للمركبات المفسفرة ، قم بتنفيذ جميع خطوات التخصيب حتى الشطف على الجليد ، وقم بتبريد جميع الكواشف إلى 4 درجات مئوية. الحفاظ على وقت الاستخراج إلى الحد الأدنى (1.5-2 ساعة). نفذ جميع خطوات الاستخراج باستخدام 1 M PA.تحضير الخرز: اغسل حبات TiO 2 (5 مجم لكل عينة) باستخدام ddH2O (1 مل) وأجهزة الطرد المركزي (3500 × جم ، 1 دقيقة ، 4 درجات مئوية). قم بإزالة ddH2O واغسل الخرز باستخدام PA (1 مل). قم بإزالة PA عن طريق الطرد المركزي (3500 × جم ، 1 دقيقة ، 4 درجات مئوية). أعد تعليق الخرز في PA (50 ميكرولتر لكل عينة). أضف المادة الطافية التي تحتوي على مركبات مفسفرة (قارن القسم 3.2 ، الخطوة 3.2.5) إلى معلق الخرزة ، الدوامة ، ثم قم بتدوير العينة لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. جهاز طرد مركزي للعينة (3500 × جم ، 1 دقيقة ، 4 درجات مئوية) وتخلص من المادة الطافية. اغسل الخرز باستخدام PA (500 ميكرولتر) وأجهزة الطرد المركزي (3500 × جم ، 1 دقيقة ، 4 درجات مئوية). تخلص من المادة الطافية وكرر خطوة الغسيل. أضف NH4OH (200 ميكرولتر ، 3٪) إلى الخرز و resupend. قم بتدوير العينة لمدة 5 دقائق عند r.t. جهاز طرد مركزي للعينة (3500 × جم ، 1 دقيقة) ونقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي جديد. كرر خطوات الشطف 3.3.4 و 3.3.5 واجمع بين eluents. تخلص من الخرز. أجهزة الطرد المركزي للشطف المدمجة (17000 × جم ، 1 دقيقة ، 4 درجات مئوية) لإزالة أي بقايا غير قابلة للذوبان. جفف المادة الطافية تماما تحت التبخر الفراغي (70 دقيقة ، 60 درجة مئوية ، V-AQ). أضف ddH2O (50 ميكرولتر) إلى المستخلصات المجففة التي تحتوي على InsPs. دوامة لخلط العينة حتى تذوب تماما. قم بتخزين العينة في -20 درجة مئوية حتى تحليل CE-ESI-MS. 4. إجراء عمليات تشغيل CE-ESI-MS تحضير مزيج من المعايير الداخلية التي تحتوي على 40 ميكرومتر [13 C 6]1,5- (PP)2-InsP 4 ، 80 ميكرومتر [13 C 6]5-PP-InsP 5 ، 80 ميكرومتر [13 C 6] 1-PP-InsP 5 ، 400 ميكرومتر [13 C 6]InsP 6 و 400 ميكرومتر [13C 6]InS(1,3,4,5,6)P 5. تحديد تركيزات محاليل SIL IS بواسطة 31P و 1H NMR ، بمساعدة معيار مرجعي معتمد ، أي حمض الفوسفواسيتيك.ملاحظة: تم تصنيع جميع معايير SIL الداخلية المذكورة أعلاه (IS) بنقاوة أعلى من 96٪ وتوفيرها بواسطة مجموعة Fiedler15,27. كما هو الحال مع النيوكليوتيدات ، يمكن أن تحمل هذه IS العديد من جزيئات الماء البلورية والأيونات المضادة المتنوعة. بدلا من وزن المادة وحساب التركيز ، يوصى بتحديد تركيز المحاليل القياسية 13C6 بواسطة 31P NMR الكمي. امزج 10 ميكرولتر من العينة مع 0.5 ميكرولتر من خليط المعايير الداخلية في قارورة عينة CE. 2 ميكرومتر [13 C 6]1,5- (PP)2-InsP 4 ، 4 ميكرومتر [13 C 6]5-PP-InsP 5 ، 4 ميكرومتر [13 C 6] 1-PP-InsP 5 ، 20 ميكرومتر [13 C 6] InsP 6 ، و 20 ميكرومتر [13C 6] Ins(1،3،4،5،6) P 5 هي التركيزات النهائية داخل العينات. عند استخدام نظام التجديد ، انقر فوق الزر ” تغيير الزجاجة” ، وضع المخزن المؤقت 250 مل من CE في زجاجة المنحل بالكهرباء ، وانقر فوق Clean Tubes. احتفظ بإبرة التجديد في قارورة ماء. قم بتعيين معلمات ESI و MS كما هو موضح في الجدول 1. تحسين معلمات المصدر باستخدام محسن المصدر مع مزيج من معايير الإينوزيتول متعدد الفوسفات. احصل على إعدادات مراقبة التفاعل المتعدد (MRM) باستخدام Masshunter Optimizer مع جميع المعايير. اضبط إعدادات ESI و MS / MS للأجهزة المختلفة. قم بإجراء تشغيل لمقتطفات InsP وتحقق من النتيجة (الشكل 2). قم بتعيين تسلسل عندما يكون هناك المزيد من العينات. دع MS يكون في وضع الاستعداد بعد القياسات. لا تقم بإيقاف تشغيل مضخة LC. يحمي تدفق سائل الغمد إبرة البخاخ. استبدل بخاخ CE-ESI-MS ببخاخ LC-ESI-MS في حالة عدم وجود إمداد سائل غمد. 5. تحليل البيانات افتح برنامج التحليل الكمي (ل QQQ) ، وقم بإنشاء دفعة لجميع العينات. قم بإنشاء طريقة جديدة من بيانات MRM المكتسبة. قم بتعيين [13C6] InsPs كمعايير داخلية – (ISTD). تحقق من إعداد مركب MRM وإعداد وقت الاستبقاء وإعداد ISTD وإعداد التركيز وإعداد المؤهل. قم بتمرير التحقق من الصحة والخروج لتطبيق الطريقة على الدفعة الحالية. احفظ الطريقة. تحقق مما إذا كانت كل قمة في الدفعة متكاملة بشكل صحيح ؛ خلاف ذلك ، قم بدمج الذروة يدويا. تصدير النتائج إلى جدول بيانات. إجراء القياس الكمي للإينوزيتول (pyro) الفوسفات من خلال مقارنة استجابة ذروة التحليل مع استجابة الذروة ذات الصلة من SIL IS مع تركيزات معروفة. يتم عرض منحنيات المعايرة النظرية والتجريبية في الجدول 2 ل 5-PP-InsP 5 و InsP 6 و Ins(1،3،4،5،6) P5 مع المدى الخطي.ملاحظة: الشرط المسبق لتطبيق منحنى المعايرة النظرية هو استخدام نمط نظيري عالي الجودة من التحليلات المستهدفة وبتركيز موثوق. تقييم النطاق الخطي. ومنحنى المعايرة ضروري للقياس الكمي المطلق عندما يكون الاكتساب الكامل للمعايير النظيرية المذكورة أعلاه غير عملي. مع التركيز المقاس في محلول استخراج InsP وحجمه ، احسب الكميات المطلقة. علاوة على ذلك ، تطبيع الكمية حسب عدد الخلايا أو محتوى البروتين. احسب التركيز الخلوي بناء على عدد الخلايا ومتوسط حجم الخلية HCT116 (1.68 fL).

Representative Results

تهدف النتائج الموضحة هنا إلى توضيح إمكانات تحليل CE-ESI-MS. الأرقام المبلغ عنها وصفية لتشغيل CE-ESI-MS الذي لا تشوبه شائبة من الناحية الفنية. أولا ، يتم تقديم مزيج من معايير إينوزيتول بيروفوسفات (الشكل 1) ومستخلص خلايا الثدييات (الشكل 2). ثانيا ، يتم توفير مقارنة بين خطي خلايا HCT116 (الشكل 3) وخلايا HCT116 المعالجة ب NaF (الشكل 4). يظهر الشكل 1 مخططات كهربائية أيونية مستخرجة (EIEs) لمعايير فوسفات الإينوزيتول (pyro) بتركيز 2 ميكرومتر. يتم إدراج التمثيل الغذائي للإينوزيتول بيروفوسفات في الثدييات مع هياكلها المبسطة. أربعة اينوزيتول بيروفوسفات في الثدييات, 1,5-(PP)2-InsP 4, 5-PP-InsP 5, 1-PP-InsP 5, و5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 مميزة بشكل جيد باستخدام الطريقة الموصوفة. تم تصوير تشغيل CE-ESI-MS ل HCT116UCL في الشكل 2. بمساعدة المعايير الداخلية الموسومة بالنظائر المستقرة (SIL) ، يمكن تحقيق كمية مطلقة بسهولة من خلال مقارنة استجابة الإشارة مع SIL المسننة ذات التركيز المعروف. يتم عرض EIEs المتكاملة من فوسفات الإينوزيتول من InsP5 إلى (PP) 2-InsP 4 و EIEs غير المتكاملة لأنماط النظائر الخاصة بهم. تقع RSDs لجميع التحليلات من ستة تكرارات فنية في حدود 4٪. مع التركيز المقاس وحجم المستخلصات ، يمكن حساب كمية التحليلات. مع عدد الخلايا وحجم الخلية ، أو محتوى البروتين ، فإن التركيز الخلوي المطلق (μM) أو الكمية التي يتم تطبيعها بواسطة محتوى البروتين (بروتين pmol / mg) هي عادة النتائج النهائية لمثل هذا التحليل. وفقا لدراسة سابقة ، فإن دفعتين من خلايا HCT116 المتباينة لها اختلاف في مستويات InsP 8 ، وتحتوي خلايا HCT116UCL على مستويات أعلى بمقدار 6 أضعاف من InsP8 من خلايا HCT116 NIH 29. باستخدام طريقة CE-MS ، يمكن بسهولة قياس 1،5- (PP) 2-InsP4 في HCT116 NIH (الشكل 3) ، وتحتوي خلايا HCT116UCL على مستويات أعلى بمقدار 7 أضعاف من InsP8 مقارنة ب HCT116 NIH. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التراكم الكبير ل 1,5- (PP) 2-InsP 4 في خلايا HCT116UCL يوازي زيادة كبيرة في 1-PP-InsP5 ، والذي يظهر الآن كميا في الشكل 3. تزداد مستويات PP-InsPs عن طريق تثبيط إزالة الفسفرة باستخدام فلوريد الصوديوم. أظهر تحليل CE-ESI-MS لخلايا HCT116NIH المعالجة ب NaF ارتفاع -5-PP-InsP 5 جنبا إلى جنب مع انخفاض في InsP 6 وظهور 5-PP-Ins (1،3،4،6) P 4 (الشكل 4). إلى جانب ذلك ، فإن ارتفاع مستويات InsP8 ملحوظ ، بينما ينخفض 1-PP-InsP5 إلى حد ما. 1-PP-InsP5 ليس غائبا تماما في HCT116NIH المعالج ب NaF ، ولكن في الغالب إما تحت حدود الكشف أو الكمية. الشكل 1: مخطط كهربي الأيونات المستخرج النموذجي (EIEs) لمعايير فوسفات الإينوزيتول (pyro) في تحليل CE-ESI-MS باستخدام البروتوكول الموصوف. تركيز كل مادة تحليل يساوي 2 ميكرومتر. حجم العينة المحقونة حوالي 10 نانولتر مع الحقن عند 50 ملي بار لمدة 10 ثوان. إدراج تظهر استقلاب بيروفوسفات الإينوزيتول في الثدييات. IPPK: إينوزيتول بنتاكيس فوسفات 2-كيناز ، IP6K: إينوزيتول هيكساكيسفوسفات كيناز ، PPIP5K: ثنائي فوسفوينوزيتول بنتاكيس فوسفات كيناز ، DIPP1: ثنائي فوسفوينوسيتولبولي فوسفات فوسفوهيدرولاز 1. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 2: ملف تعريف InsP التمثيلي لخلايا HCT116UCL. (أ) EIEs من فوسفات الإينوزيتول (pyro) الرئيسي في HCT116NIH و SIL ISs المسننة 2 ميكرومتر [13 C 6] 1،5- (PP) 2-InsP 4 (1) ، 4 ميكرومتر [13 C 6] 5-PP-InsP 5 (2) ، 4 ميكرومتر [13 C 6] 1-PP-InsP5 (3) ، 20 ميكرومتر [13C 6] InsP 6 (4)، و 20 ميكرومتر [13C 6] بوصة (1،3،4،5،6) P 5 (5). تظهر الإدخالات ستة تكرارات فنية لتحليل InsP بواسطة CE-ESI-MS ، ويتم تقديم البيانات كوسيلة ± SD. (ب) التركيز الخلوي ل PP-InsPs و InsPs في خطوط الخلايا البشرية HCT116UCL و (C) كمية PP-InsPs و InsPs طبيعية حسب محتوى البروتين. البيانات هي وسائل ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 3: الاختلاف في مستويات InsP8 بين خليتين متباعدة HCT116. (أ) EIEs من إينوزيتول بيروفوسفات في HCT116 UCL و HCT116NIH. InsP8 في HCT116UCL أكثر وفرة بشكل ملحوظ من HCT116NIH. (ب) نسبة الإينوزيتول بيروفوسفات إلى InsP6 (٪) في كل من خلايا HCT116. تحتوي خلايا HCT116UCL على مستويات أعلى بمقدار 7 أضعاف من InsP8 مقارنة ب HCT116NIH ، في حين أن مستويات 5-PP-InsP5 متساوية. البيانات هي وسائل ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 4: مستويات فوسفات الإينوزيتول (pyro) في خلاياالمعاهد الوطنية للصحة HCT116 ، مع علاج NaF. (أ) EIEs من فوسفات الإينوزيتول (pyro) في HCT116NIH مع معالجة فلوريد الصوديوم (NaF ، 10 mM). مستويات الإينوزيتول بيروفوسفات بما في ذلك 1،5-(PP)2-InsP 4, 5-PP-InsP 5, و5-PP-Ins(1,3,4,6) P4 زيادة عن طريق منع إزالة الفسفرة باستخدام NaF. (ب) مستويات فوسفات الإينوزيتول (pyro) (يتم تطبيع الكميات حسب محتوى البروتين) في خلاياالمعاهد الوطنية للصحة HCT116 غير المعالجة والمعالجة ب NaF. البيانات هي وسائل ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الجدول 1: إعدادات معلمة CE-ESI-MS. تم تحسين معلمة المصدر ومعلمات iFunnel بواسطة محسن المصدر و iFunnel. تم تحسين إعدادات معلمة MSM للإينوزيتول (pyro) الفوسفات بواسطة MassHunter Optimizer. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول. الجدول 2: معادلة الانحدار النظرية والتجريبية. تركيز [13 C 6]5-PP-InsP 5 [13 C 6] InsP 6 ، و [13C 6] Ins (1 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6) P 5 هو 4 ميكرومتر و 20 ميكرومتر و 20 ميكرومتر على التوالي. بالنسبة لمعادلة الانحدار ، يكون تركيز 5-PP-InsP 5 عند 0.04 ميكرومتر ، 0.1 ميكرومتر ، 0.2 ميكرومتر ، 0.4 ميكرومتر ، 1 ميكرومتر ، 2 ميكرومتر ، 4 ميكرومتر ، 8 ميكرومتر ، 16 ميكرومتر ، 24 ميكرومتر. تركيز InsP 6 و Ins (1 ، 3 ، 4 ، 5 ،6) تركيز P 5 عند 0.2 ميكرومتر ، 0.5 ميكرومتر ، 1 ميكرومتر ، 2 ميكرومتر ،5 ميكرومتر ، 10 ميكرومتر ، 20 ميكرومتر ، 40 ميكرومتر ، 80 ميكرومتر ، 120 ميكرومتر. x هو التركيز ، y هو (المنطقة InsP) 12C / (المنطقة InsP) 13C. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Discussion

هنا هو طريقة عملية وحساسة لتحديد كمية بيروفوسفات الإينوزيتول عالي الشحنة في خلايا الثدييات. من خلال الجمع بين نهج التحليل هذا واستخراج InsP الحالي المتطور مع حمض البيركلوريك متبوعا بالتخصيب باستخدام TiO2 ، يتمتع تحليل CE-ESI-MS بمزايا غير مسبوقة. فيما يتعلق بالإنتاجية ، والحساسية ، والاستقرار ، والكمية المطلقة ، وتحديد الأيزومر ، واعتماد المصفوفة ، تبرز هذه الطريقة مقارنة بالأساليب الأخرى. ينطبق هذا البروتوكول على خلايا الثدييات ، ولكن في الواقع تنجح هذه الاستراتيجية في العديد من العينات المختلفة (على سبيل المثال ، الخميرة ، والنباتات ، والطفيليات ، وأنسجة الفئران ، وما إلى ذلك).

يستعيد بروتوكول الاستخراج المطبق PP-InsPs و InsP6 بالكامل من مستخلصات خلايا الثدييات16,19. كما سيستخرج العديد من المستقلبات الأنيونية الأخرى ، وخاصة الأنواع المحتوية على الفوسفات ، على سبيل المثال ، فوسفات السكر والنيوكليوتيدات. سيكون من الضروري تقييم الاسترداد والتحلل لتحليلات المستخدم باستخدام هذا البروتوكول.

بشكل عام ، يعمل نظام CE-ESI-MS بسلاسة ويمكن أن يستوعب حوالي 200 عينة كل أسبوع باستخدام هذا البروتوكول. على عكس HPLC ، على الرغم من ذلك ، تم اعتبار CE طريقة للخبراء والأشخاص المتخصصين لفترة طويلة ، مما قيد سوقها وحد من تطبيقها. وبالتالي ، عادة ما يكون جهاز CE-ESI-MS غائبا في الكليات التحليلية. ربما يفتقر الأشخاص الذين يرغبون في إجراء تحليل CE-ESI-MS إلى خبرة CE وسيقضون المزيد من الوقت في استكشاف الأخطاء وإصلاحها. هنا ، يتم تسليط الضوء على الخطوات الحاسمة. أولا وقبل كل شيء هي نوعية قطع الشعيرات الدموية. تعتمد حساسية واستقرار رذاذ ESI في الغالب على قطع شعري من الدرجة الأولى. ثانيا ، يجب أن تكون نهاية مخرج الشعيرات الدموية 0.1 مم بالضبط من طرف البخاخ. يجب أن تكون إبرة البخاخ والشعيرات الدموية CE في الاتجاه المحوري. جودة رذاذ ESI أمر بالغ الأهمية للقياس الكمي. يجب إجراء عمليات تشغيل فنية لتقييم التكرار.

مع البروتوكول الموصوف ، يكون حد القياس الكمي (LOQ) ل PP-InsPs هو 40 نانومتر مع حقنة عند 50 ملي بار لمدة 10 ثوان (10 نانولتر). هناك عدة طرق لزيادة حساسية الطريقة. أولا ، سيظل الحقن عند 100 ملي بار لمدة 20 ثانية (40 نانولتر) يؤدي إلى شكل ذروة جيد ودقة كافية ل regioisomers 5-PP-InsP 5 و 1-PP-InsP5. ثانيا ، يمكن إذابة مستخلصات InsP في كمية أقل من الماء. ثالثا ، يمكن زيادة وقت السكون عند استخدام انتقالات MRM أقل للقياس. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مصدر أيون CE-MS باستخدام تدفق سائل غمد منخفض للغاية سيزيد بشكل كبير من الحساسية.

يوفر المخزن المؤقت لتشغيل CE مع الرقم الهيدروجيني 9 أفضل دقة بين InsP 6-InsP 8. عند زيادة الرقم الهيدروجيني إلى 9.7 ، ستتحسن الدقة بين InsP3-InsP 6 بشكل كبير. نظرا للدقة الممتازة ، يوصى بطول شعري أقصر يبلغ 72 سم لزيادة الإنتاجية. إلى جانب ذلك ، فإن ارتفاع درجة حرارة الكاسيت CE عند 40 درجة مئوية يقلل من لزوجة المخزن المؤقت الكهربائي المائي ويسرع حركتها تحت EOF. وفقا لمتطلبات البحث المختلفة ، يمكن أن تؤدي تعديلات هذه الطريقة إلى تسهيل تحليل InsPs و PP-InsPs. لذلك ، فإن بروتوكولات CE-ESI-MS الموصوفة لديها القدرة على فتح طرق بحثية جديدة في هذه العائلة متعددة الأوجه من جزيئات الإشارة.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

حصل هذا المشروع على تمويل من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي (اتفاقية المنحة رقم 864246 ، إلى HJJ). تقر DQ بالدعم المالي من برنامج Brigitte-Schlieben-Lange. يتم دعم AS من خلال منحة برنامج MRC MR / T028904 / 1.

Materials

Materials
1.5 mL microcentrifuge tubes Greiner Bio-One 616201 –
15 cm tissue culture dishes Thermo Fisher 168381 –
2.0 mL microcentrifuge tubes Greiner Bio-One 623201 –
50 mL centrifuge tubes Greiner Bio-One 227261 –
96-well plates Thermo Fisher 260836 for the DC protein assay
CE fused silica capillary CS Chromatographie 105180 50 µM i.d. 360 µM o.d.
Pipette tips Starlab I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700 10 mL, 1000 µL, 200 µL, 10 µL pipette tips
Serological pipets TPP 94550, 94525, 94010, 94005 50 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL serological pipettes
T75 flasks TPP 90076 –
Chemicals and Reagents
NaOH AppliChem A6829,0500 sodium hydroxide pellets for molecular biology, for preparation of cell lysis buffer
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200056 –
Ammonium acetate Thermo Fisher 1677373 HPLC grade
BSA Thermo Fisher 23209 albumin standard (2.0 mg/mL) for standard curve preparation
DC protein assay Biorad 5000116 DC protein assay reagents package
DMEM Gibco 41966029 high glucose, pyruvate
FBS Gibco 10270106, 10500064 (heat inactivated) 10270106 for HCT116UCL, 10500064 for HCT116NIH
Isopropanol Carl Roth AE73.2 99.95% LC-MS grade
NH4OH, 10% Carl Roth 6756.1 for preparation of 3% NH4OH
PBS Gibco 10010015 –
Perchloric acid, 70% Carl Roth 9216.1 for preparation of 1 M perchloric acid
SDS SERVA 20760.02 for preparation of cell lysis buffer
Sodium fluoride Sigma Aldrich S7920 –
TiO2 beads GL Sciences 5020-75000 5 µm particle size
Trypan blue solution Gibco 15250061 trypan blue stain (0.4%)
Ultrapure (Type 1) water Milli-Q ZRQSVP3WW model: Direct-Q 3 UV Water Purification System
Equipment
Analytical balance Mettler Toledo 30105893 model: XPE26; for weighing of beads (5-6 mg per sample)
Automated cell counter Logos Biosystems L40002 model: LUNA-II Automated Cell Counter
Benchtop centrifuge Hettich 1401 model: UNIVERSAL 320
Benchtop centrifuge with cooling VWR 521-1647P model: Microstar 17R
CE system Agilent G7100A –
CE/MS Adapter Kit Agilent G1603A –
CE/MS Sprayer Kit Agilent G1607A –
Cell counting slides Logos Biosystems L12001 LUNA Cell Counting Slides
Centrifugal evaporator Eppendorf 5305000304 model: Concentrator plus complete system
ESI source Agilent AJS ESI –
Humidified incubator Binder 9040-0088 model: CB E6.1, for cultivation of mammalian cells
Ice box – – should provide enough space for samples, dishes, etc.
Isocratic LC system Agilent G7110B 1260 Iso Pump model: Infinity II Quaternary system
MSD Agilent G6495C triple quadrupole
Multiplate reader Tecan 30086375 model: SPARK 10 M
Pipette filler Thermo Fisher 10072332 for serological pipettes
Pipettes Brand 705884, 705880, 705878, 705872, 705870 various pipettes
Rotator Labnet H5500 model: Mini LabRoller Rotator
Shortix capillary column cutter SGT S0020 –
Test tube shaker (vortex mixer) Carl Roth HXH6.1 model: Rotilabo-Mini Vortex
Tilt table Labnet S0600 model: EDURO MiniMix Nutating Mixer
Water bath Thermo Fisher FSGPD05 model: Isotemp GPD 05
Software
MassHunter Workstation Agilent Version 10.1 –
MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition Agilent Version 10.1 –
MassHunter Workstation Optimizer Agilent Version 10.1 –
MassHunter Workstation Qualitative Analysis Agilent Version 10.0 –
QQQ Quantitaion Analysis Agilent Version 10.1 –
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Stephens, L., et al. The detection, purification, structural characterization, and metabolism of diphosphoinositol pentakisphosphate(s) and bisdiphosphoinositol tetrakisphosphate(s). The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 4009-4015 (1993).
  2. Menniti, F. S., Miller, R. N., Putney, J. W., Shears, S. B. Turnover of inositol polyphosphate pyrophosphates in pancreatoma cells. The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 3850-3856 (1993).
  3. Shears, S. B. Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates. Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).
  4. Irvine, R. F., Schell, M. J. Back in the water: the return of the inositol phosphates. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (5), 327-338 (2001).
  5. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  6. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  7. Chakraborty, A., et al. Inositol pyrophosphates inhibit Akt signaling, thereby regulating insulin sensitivity and weight gain. Cell. 143 (6), 897-910 (2010).
  8. Bittner, T., et al. Photolysis of caged inositol pyrophosphate InsP8 directly modulates intracellular Ca2+ oscillations and controls C2AB domain localization. Journal of the American Chemical Society. 142 (24), (2020).
  9. Hauke, S., et al. Photolysis of cell-permeant caged inositol pyrophosphates controls oscillations of cytosolic calcium in a β-cell line. Chemical Science. 10 (9), 2687-2692 (2019).
  10. Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14206-14211 (2002).
  11. Koldobskiy, M. A., et al. p53-mediated apoptosis requires inositol hexakisphosphate kinase-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (49), 20947 (2010).
  12. Rao, F., et al. Inositol hexakisphosphate kinase-1 mediates assembly/disassembly of the CRL4-signalosome complex to regulate DNA repair and cell death. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16005 (2014).
  13. Williams, S. P., Gillaspy, G. E., Perera, I. Y. Biosynthesis and possible functions of inositol pyrophosphates in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 67 (2015).
  14. Wilson, M. S. C., Livermore, T. M., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates: between signalling and metabolism. The Biochemical Journal. 452 (3), 369-379 (2013).
  15. Harmel, R. K., et al. Harnessing 13C-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR. Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).
  16. Qiu, D., et al. Analysis of inositol phosphate metabolism by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nature Communications. 11 (1), 6035 (2020).
  17. Azevedo, C., Saiardi, A. Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast. Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).
  18. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of radioactive labelling to elucidate inositol polyphosphate signalling. Phosphate Labeling and Sensing in Chemical Biology. , 67-87 (2017).
  19. Wilson, M. S. C., Bulley, S. J., Pisani, F., Irvine, R. F., Saiardi, A. A novel method for the purification of inositol phosphates from biological samples reveals that no phytate is present in human plasma or urine. Open Biology. 5 (3), 150014 (2015).
  20. Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis. PloS One. 4 (5), 5580 (2009).
  21. Dong, J., et al. Inositol pyrophosphate InsP8 acts as an intracellular phosphate signal in arabidopsis. Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).
  22. Riemer, E., et al. ITPK1 is an InsP6/ADP phosphotransferase that controls systemic phosphate homeostasis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2020).
  23. Whitfield, H., et al. An ATP-responsive metabolic cassette comprised of inositol tris/tetrakisphosphate kinase 1 (ITPK1) and inositol pentakisphosphate 2-kinase (IPK1) buffers diphosphosphoinositol phosphate levels. The Biochemical Journal. 477 (14), 2621-2638 (2020).
  24. Ito, M., et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. Journal of chromatography. A. 1573, 87-97 (2018).
  25. Mantilla, B. S., Amaral, L. D. D., Jessen, H. J., Docampo, R. the inositol pyrophosphate biosynthetic pathway of Trypanosoma cruzi. ACS Chemical Biology. 16 (2), 283-292 (2021).
  26. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Inositol phosphates purification using titanium dioxide beads. Bio-Protocol. 8 (15), 2959 (2018).
  27. Puschmann, R., Harmel, R. K., Fiedler, D. Scalable chemoenzymatic synthesis of inositol pyrophosphates. Bioquímica. 58 (38), 3927-3932 (2019).
  28. Gu, C., et al. KO of 5-InsP7 kinase activity transforms the HCT116 colon cancer cell line into a hypermetabolic, growth-inhibited phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 11968-11973 (2017).
  29. Gu, C., Wilson, M. S. C., Jessen, H. J., Saiardi, A., Shears, S. B. Inositol Pyrophosphate Profiling of Two HCT116 Cell Lines Uncovers Variation in InsP8 Levels. PloS One. 11 (10), 0165286 (2016).

Tags

Inositol PyrophosphatesCapillary ElectrophoresisElectrospray IonizationMass SpectrometryCE-ESI-MSInositol Phosphate MetabolismQuantitationBiosynthetic PathwayCE Running BufferSheath LiquidCapillary ColumnESI SprayerInositol Phosphate Standards

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Qiu, D., Eisenbeis, V. B., Saiardi, A., Jessen, H. J. Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (174), e62847, doi:10.3791/62847 (2021).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image