Tanımlanmış Bir Motor Nöron için Nöromüsküler Kavşaktaki Değişiklikleri Tespit Etmek için Drosophila Yetişkin Bacağının Diseksiyonu ve İmmünhistokimyası

Bu protokolle birlikte kullanılan çalışma çözümlerini hazırlama yordamları Tablo 1’de açıklanmıştır. Reaktif Hazırlık Depolama PBS Damıtılmış suda seyrelterek 10x PBS stok çözeltisinden 1x PBS çalışma stoğu yapın.  Çalışan PBS stokunun pH’ı 7.2- 7.4 olmalıdır Bakteriyel kontaminasyon görünene kadar 1+ ay boyunca 4 °C. PBT %0,1 iyonik olmayan yüzey aktif maddeli 1x PBS çözümü. Bakteriyel kontaminasyon görünene kadar 1+ ay boyunca 4 °C. FA % 37 formaldehit stoğundan yapılan ve 1x PBS’de seyreltilen% 3.7 formaldehit çözeltisi. Oda sıcaklığı. Diseksiyon her gün taze olun DİkKAT: stok çözeltisi olarak sağlanan formaldehit potansiyel bir kanserojendir ve duman kaputunda seyreltilmelidir. %5 NGS PBT’de %5 normal keçi serumu seyreltilmiştir.  Kullanılan serum kullanılacak ikincil antikorun türüyle eşleşmelidir. Bakteriyel kontaminasyon görünene kadar birkaç hafta boyunca 4 °C Tablo 1. Yetişkin Drosophila bacağının immünosistosistini yapmak için çözümler . 1. Dokuların ilk sabitlenmesi Her genotip ve yaş için yaklaşık 10 sinek seçin. Karbondioksit altındaki bir sineklik üzerinde anestezi (Şekil 1A, B).NOT: Diseksiyondan sonra yeterince büyük bir örnek boyutu sağlamak için gerekenden daha fazla sinekle başlayın. Bir boya fırçası kullanarak, yaklaşık 30 saniye ila 1 dakika boyunca bir cam kuyuda veya tabakta soğuk metanollere uçar (Şekil 1C). Metanol, küküler hidrokarbonları çözünür ve sinekler artık sulu çözeltilerde yüzmek yerine batırılabilir. Kanatlarla, sinekleri PBS’ye dikkatlice aktarın. Fazla metanol gidermek ve pbs sinekleri diseksiyon ve fiksasyona kadar buz üzerinde tutmak için buz gibi PBS’de 3x durulayın. Bu noktada, sinekleri parçalara ayırın ve mümkün olan en kısa sürede sabitleyin (<30 dakika). Bacakları izole etmek için, sinekleri soğuk PBS ile dolu silikon bir elastomer diseksiyon kabına aktarın, iki çift #5 Dumont tokası kullanarak coxa’daki metatorasik bacakları çıkarın veya bacakları Vanna makasıyla kesin (Şekil 1D). Bacakları 1 mL PBS ile dolu plastik 24 kuyu plakasındaki bir kuyuya aktarın ve tüm bacaklar çıkarılıp kuyulara transfer edilene kadar plakayı buzda tutun.NOT: Her kuyu en az 20 bacak tutabilir. PBS çözeltisini 1 mL FA çözeltisi ile değiştirin ve bir somun makinesinde 30 dakika döndürün (Şekil 1E). Somun makinesi ayarı orta hızda (17 rpm) ayarlanmalıdır. Yeterli fiksasyon için bu süre zarfında bacakların tamamen FA çözeltisi içine batırıldığından emin olun. SK çözeltisini çıkarmak için, 1 mL PBS 3x’te hızlı bir şekilde yıkayın ve ardından 1 mL PBS’de her biri 5 dakika boyunca ek 3 yıkama yapın. Dokuları, aşağıda açıklanan diseksiyon adımlarından önce ve sırasında buz üzerinde 1 mL PBS’de tutun. 2. Bacak Oksikül ve Antikor Lekesinin Giderilmesi Bacak manikülü çıkarma Diseksiyon forsepsleri başarı için kritik öneme sahiptir. Kütiküllerin dürtmek yerine yüzeysel olarak ele geçirildiğini sağlayan bir eğim sağlamak için #5 süper ince önkurunun sonundaki her iki uçta hafif paralel bükümler tanıtın, bu da dokuyu mahvedebilir (Şekil 1F, G).NOT: Paralel olarak bükülen uçlar, kapatıldığında çatalın uzunluğu boyunca birbirleriyle temas etmelidir (Şekil 2). Bacakları diseksiyon için PBS’deki silikon elastomer kabına aktarın. Ön taraf yukarı bakacak şekilde bir bacağı yönlendirin (bacak anatomisi ve oryantasyon bilgileri için Şekil 3’e bakın). Bir çift asa kullanarak kaval kemiği segmentini silikon elastomer kabına doğru tutun. Eğim tarafını aşağı tutan diğer pervaneleri kullanarak, uyluk kemiğinin distal ucunda bir parça kütikül alın ve trokantere doğru proksimal yönde çekin. Uyluk kemiğinin proksimal ucunda çıplak kas görünene kadar manikürden metodik olarak çıkarmaya devam edin (Şekil 1F, G, H).NOT: Kas çekmeyi önlemek için sadece pervanelerin eğimli tarafını kullanarak bacaklarla yüzeysel temas kurun. Tüm bacaklar parçalandıktan sonra, PBS’yi FA ile değiştirerek bacakları 30 dakika boyunca orta hızda bir somunu titretmek için sabitleyin (Şekil 1I). Numuneleri 1 mL PBS’de 3 kat hızlı ve ardından PBT’de 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın (Şekil 1J).NOT: Aktif bölgeleri etiketlemek için monoklonal antikor NC82 (anti-bruchpilot) ile lekelenme varsa, bu antijen daha uzun fiksasyonlara duyarlı olduğu için 20 dakika boyunca düzeltme sonrası. Şekil 2. Yetişkin bacaklarının diseksiyon için kullanılan modifiye forseps. (A) Pervanelerin uçları bükülür ve daha sonra altta düzleştirilir (ok) bir bileme taşına törpürlenerek bir eğim oluşturur. (B) Buna karşılık, değiştirilmemiş asaların uçları bükülmez. Ölçek çubuğu = 1 mm Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Antikor boyama Antikor boyama için dokuları bloke etmek için, 1 mL PBT’yi PBT’de seyreltilmiş% 5 NGS’nin 1 mL’lerinden oluşan blokaj çözeltisi ile değiştirin. Oda sıcaklığında 4 saat boyunca veya orta hızda (17 rpm) bir somun makinesinde sallanırken 4 °C’de gece boyunca parçalanmış bacakları kuluçkaya bırakın. Tüm inkübasyonlar sırasında, plastik kapağın yanı sıra sızdırmazlık bandı ile kuyuları örtün (Şekil 1J).NOT: 1,5 mL veya 2 mL mikrosantrifüj yerine immünosimya için 24 kuyu plakası kullanılır, çünkü mikrosantrifüj tüplerini kullanmaya yönelik önceki girişimler kırık bacaklara ve hasarlı dokuya neden oldu. Blokaj çözeltisini çıkarın ve taze blokaj çözeltisinde seyreltilmiş 300 mL birincil antikor ekleyin. Kullanılan küçük hacimli antikor dokuları örtmek için yeterli olmalıdır. Kuyuları laboratuvar sızdırmazlık bandı ve plastik kapakla yeniden kapatın ve orta hızda bir somun makinesinde sallanarak 4 °C’de gece boyunca kuluçkaya yatırın (Şekil 1J). Bu çalışmalarda kullanılan antikor reaktif bilgileri ve konsantrasyonları Tablo 2’de açıklanmıştır. Primer antikorları 1 mL PBT’de 3 kez kısa bir süre ve ardından her biri 15 dakika boyunca 3 kez yıkayın (Şekil 1J).NOT: Seyreltilmiş primer antikorlar 4 °C’de 2 haftaya kadar saklanırsa kaydedilebilir ve tekrar kullanılabilir. Dokuları oda sıcaklığında en az 2 saat veya gece boyunca 4 C’de 1 mL%5 NGS’de tekrar bloke edin (Şekil 1J). % 5 NGS engelleme çözeltisini çıkarın ve uygun seyreltilmiş floresan konjuge ikincil antikorların 300 μL’sini ekleyin. Ek olarak, etiket kasına floresan konjuge phalloidin 1:2000 seyreltme ekleyin (Şekil 1J). İkincil antikor inkübasyonları için kuyuları laboratuvar sızdırmazlık bandı ve kapakla kapatın. Ayrıca, floroforları ışıktan korumak için plakaları alüminyum folyoya sarın. Oda sıcaklığında veya 4 °C’de gece boyunca 6-8 saat kuluçkaya yatırın. Yukarıdaki adım 2.2.3’te açıklandığı gibi ikincil antikorları ve phalloidinleri yıkayın. Floroforları ışıktan korumak için yıkamaların arasında alüminyum folyolu kapak plakaları. 3. Montaj Ayakları Bacakları uzunlayıp ön tarafı yukarı doğru yönlendirerek bir slayda aktarın. Bacakları montaj ortamı ile örtün (Şekil 1K, L).NOT: Alt delik jiletle kesilerek genişletilirse, parçalanmış bacaklar P1000 pipet ucu ile aspire edilebilir. Kapak köşelerini küçük bir modelleme kili topu boyunca kazıyarak 22×22 mm2 kapakçık (#1,5 kalınlığı) kil ara parçaları ekleyin. Her köşede 1-2 mm kalınlığında az miktarda kil olmalıdır (Şekil 1K). Slaydı örtmek için, kapakçığı kaydırağa bakan kil aralayıcılarla ekleyin ve kapak parçası uyluk kemiğinin yüzeyine dokunana kadar köşeleri dikkatlice itin. Buharlaşmayı önlemek için, kapak kapağının kenarlarını oje ile kapatın ve görüntülemeye kadar 4 °C’de saklamadan önce karanlık bir yerde (yaklaşık 10 dakika) kurumaya bırakın. 4. Görüntüleme Konfokal mikroskop ile görüntü (Şekil 1M). Diseksiyonun kalitesini daha iyi değerlendirmek için iletilen bir ışık kanalı ekleyin ve ilgi alanındaki gözle görülür şekilde bozulmuş kas liflerine sahip örnekler atılmalıdır. 2x yakınlaştırma ve uyluk kemiğinin kalınlığına karşılık gelen ~ 40 mm toplam görüntü derinliği ile 20x büyütme ile z yığınlarını görüntülemeye başlayın. Floresan sinyal algılama için, Nyquist örneklemesi ile tutarlı çözünürlüklerde görüntüler yakalayın (8-10 μs / piksel bekleme ayarına sahip 1024 x 1024 piksel kullanıyoruz). Sinyal yoğunluğu, yüksek voltaj kazanç ayarlarının ayarlanmasıyla elde edilen doğrusal aralıkta olmalıdır. Bir deneme içindeki bir dizi örnek için kazanç ayarları ayarlandıktan sonra, sinyal yoğunluklarının örnekler arasında karşılaştırılabilmesi için değiştirilmemelidir. Sinaptik boutonları ve diğer hücre altı yapıyı görüntülemek için, konfokal görüntüleri ≥60x büyütmede yakalayın. Dedektör ayarları doğrusal aralıkta olmalı, piksel yoğunluğu, bekleme ayarları ve z derinliği ise daha düşük büyütmede yakalanan görüntüler için benzer olmalıdır (adım 4.1).