확인된 모터 뉴런을 위한 신경근육 정션에서 변경을 검출하기 위하여 Drosophila 성인 다리의 해부 및 면역 조직 화학

이 프로토콜과 함께 사용되는 작업 솔루션을 준비하기 위한 절차는 표 1에 설명되어 있습니다. 시약 준비 보관 PBS 증류수에서 희석하여 10배 PBS 스톡 솔루션에서 1배 PBS의 작업 재고를 만드십시오.  작업 PBS 주식의 pH는 7.2- 7.4이어야한다 세균 오염이 보일 때까지 1 개월 이상 4 °C. PBT 0.1% 비이온 계면활성제의 1x PBS 용액. 세균 오염이 보일 때까지 1 개월 이상 4 °C. 파 3.7% 포름알데히드 용액은 37% 포름알데히드 주식으로 만들어졌으며 1배 PBS로 희석됩니다. 실온. 해부의 매일 신선한 만들기 주의: 37%의 주식 용액으로 공급되는 포름알데히드는 잠재적인 발암물질이며 연기 후드에 희석되어야 합니다. 5% NGS PBT에서 희석된 일반 염소 혈청의 5%  사용되는 혈청은 사용될 이차 항체의 종과 일치해야 한다. 세균 오염이 보일 때까지 몇 주 동안 4 °C 표 1. 성인 Drosophila 다리 의 면역 세포 화학을 수행하기위한 솔루션. 1. 조직의 초기 고정 각 유전자형과 나이에 대해 약 10개의 파리를 선택합니다. 이산화탄소 아래 플라이 패드에서 마취(그림 1A, B).참고: 해부 후 충분한 샘플 크기를 보장하기 위해 필요한 것보다 더 많은 파리로 시작합니다. 페인트 브러시를 사용하여 유리 우물또는 접시에 차가운 메탄올로 파리를 약 30초에서 1분 동안 옮춥니다(그림 1C). 메탄올은 큐티큘러 탄화수소를 용해시키고 파리는 수성 용액에 떠 다니기보다는 침수될 수 있습니다. 집게로 조심스럽게 PBS로 이동합니다. 얼음처럼 차가운 PBS에서 3x를 헹구고 과잉 메탄올을 제거하고 해부및 고정이 될 때까지 PBS에서 얼음으로 날아갑니다. 이 시점에서, 해부 파리와 가능한 짧은 시간 (<30 분) 이내에 수정. 다리를 분리하려면 차가운 PBS로 채워진 실리콘 탄성 탄성 방부 접시로 파리를 옮기고, #5 Dumont 집게 두 쌍을 사용하여 coxa에서 메타토라시 다리를 제거하거나 Vanna 가위로 다리를 잘라냅니다 (그림 1D). 1mL의 PBS로 채워진 플라스틱 24 웰 플레이트에서 다리를 우물로 옮기고 모든 다리가 제거되고 우물로 옮겨질 때까지 접시를 얼음 위에 놓습니다.참고: 각 우물은 적어도 20개의 다리를 보유할 수 있습니다. PBS 솔루션을 FA 용액 1mL로 교체하고 30분 동안 누에이터에서 회전합니다(그림 1E). 누에이터 설정은 중간 속도(17rpm)로 설정해야 합니다. 적절한 고정을 위해이 시간 동안 다리가 FA 솔루션에 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오. FA 용액을 제거하려면 PBS 3x의 1mL로 빠르게 세척한 다음 PBS 1mL로 5분 동안 3개의 세척을 추가로 세척합니다. 아래에 설명된 해부 단계 동안 PBS1mL의 조직을 얼음 에 보관하십시오. 2. 다리 큐티클 및 항체 염색 제거 다리 큐티클 제거 해부 포셉은 성공에 매우 중요합니다. #5 슈퍼 미세 포셉의 끝에 있는 두 갈래에 약간의 병렬 굴곡을 도입하여 큐티클을 찌르지 않고 피상적으로 잡을 수 있는 벨을 제공하여 조직을 망칠 수 있습니다(그림 1F, G).참고: 병렬로 구부러진 프롱은 닫을 때 프롱 길이 전체에 걸쳐 서로 접촉해야 합니다(그림 2). 해부를 위해 PBS의 실리콘 엘라스토머 접시에 다리를 옮기습니다. 전방 측이 위를 향하도록 다리를 방향을 지정합니다(다리 해부학 및 방향 정보는 그림 3 참조). 한 쌍의 집게를 사용하여 실리콘 엘라스토머 접시에 경골 세그먼트를 잡습니다. 다른 집게를 사용하여 베벨 쪽을 아래로 잡고, 대퇴골의 말단 끝에 큐티클 조각을 잡고 트로 챈터를 향해 근위 방향으로 당깁니다. 대퇴골의 근위 쪽 끝에 걸쳐 벌거벗은 근육이 보일 때까지 체계적으로 큐티클을 제거하십시오(도 1F, G, H).참고: 근육을 당기는 것을 피하기 위해 집게의 경사진 면을 사용하여 다리와 피상적으로만 접촉합니다. 모든 다리가 해부되면 PBS를 FA로 교체하여 중간 속도로 누에이터를 흔들어 30 분 동안 다리를 수정합니다 (그림 1I). PBS 1mL로 샘플을 3배 빠르고 PBT에서 각각 5분간 3회 세척합니다(그림 1J).참고: 단일 클론 항체 NC82 (항 브루치 파일럿)로 염색하여 활성 영역에 라벨을 붙이는 경우,이 항원이 더 긴 고정에 민감하기 때문에 20 분 동안 수정 후 수정하십시오. 그림 2. 성인 다리를 해부하는 데 사용되는 수정 된 집게. (A) 집게의 끝이 구부러진 다음 바닥(화살표)에서 평평해져 서두르는 돌에 제출하여 bevel을 만듭니다. (B) 반대로 수정되지 않은 집게의 갈래는 구부러지지 않습니다. 스케일 표시줄 = 1mm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 항체 염색 항체 염색을 위한 조직을 차단하기 위하여는, PBT의 1mL를 PBT에서 희석한 5% NGS의 1mL로 구성된 블로킹 용액으로 대체하십시오. 해부된 다리를 실온에서 4시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양하고 중간 속도(17rpm)로 누에이터에 흔들리고 있습니다. 모든 인큐베이션 동안 플라스틱 커버 (그림 1J)뿐만 아니라 밀봉 테이프로 우물을 덮습니다.참고: 24개의 웰 플레이트는 미세원심분리기 튜브를 사용하려는 이전의 시도가 다리가 부러지고 조직이 손상되기 때문에 1.5mL 또는 2mL 마이크로센트심분리기보다는 면역 세포화학에 사용됩니다. 차단 용액을 제거하고 신선한 차단 용액에 희석 된 1 차 항체의 300 mL을 추가하십시오. 사용되는 항체의 소량은 조직을 커버하기에 충분해야합니다. 실험실 밀봉 테이프와 플라스틱 뚜껑으로 우물을 다시 밀봉하고 중간 속도로 누에이터에 흔들어 4 °C에서 하룻밤 배양 (그림 1J). 이러한 연구를 위해 사용되는 작동 항체 시약 정보 및 농도는 표 2에 설명되어 있습니다. 1차 항체를 PBT 1mL로 3회 간간 세척한 다음 각각 15분 동안 3회 세척한다(그림 1J).참고: 희석된 1차 항체는 최대 2주 동안 4°C에 저장하면 저장하고 재사용할 수 있다. 실온에서 2시간 이상 또는 4C(그림 1J)에서 1mL의 5% NGS로 조직을 다시 차단합니다. 5% NGS 차단 용액을 제거하고 적절한 희석 형광 공주 이차 항체의 300 μL을 추가합니다. 또한, 추가 1:2000 형광 -컨쥬게이트 남근의 희석 을 라벨 근육에 (그림 1J). 이차 항체 인큐베이션의 경우 실험실 밀봉 테이프와 뚜껑으로 우물을 밀봉하십시오. 또한 알루미늄 호일에 플레이트를 싸서 빛으로부터 형광을 보호합니다. 실온에서 6-8시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 상기 2.2.3 단계에서 설명된 바와 같이 이차 항체 및 프할로이드신을 세척한다. 알루미늄 호일로 플레이트를 세정 사이에 덮어 빛으로부터 형광을 보호합니다. 3. 다리 장착 다리를 집게와 오리엔트 전방 측면을 사용하여 슬라이드로 옮기십시오. 장착 미디어로 다리를 덮습니다(그림 1K, L).참고: 해부된 다리는 면도날로 절단하여 바닥 보어가 넓어지면 P1000 파이펫 팁으로 흡인될 수 있습니다. 22×22 mm2 커버슬립(#1.5 두께)에 클레이 스페이서를 추가하여 작은 모델링 클레이 볼을 가로질러 커버슬립 모서리를 긁어냅니다. 각 모서리에는 소량의 점토가 1-2mm 두께여야 합니다(그림 1K). 슬라이드를 덮려면 진흙 스페이서가 슬라이드를 향하고 있는 커버슬립을 추가하고 커버슬립이 대퇴골 표면에 닿을 때까지 조심스럽게 모서리를 밀어 넣습니다. 증발을 방지하기 위해, 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하고 이미징 까지 4 ° C에 저장하기 전에 어두운 장소 (약 10 분)에서 건조하게. 4. 이미징 공초점 현미경에 의한 이미지 (그림 1M). 해부의 품질을 더 잘 평가하기 위해 전달된 광 채널을 포함하고 관심 영역에서 눈에 띄게 중단된 근육 섬유를 가진 시료를 폐기해야 합니다. 2배 줌으로 20배 배율로 이미징 z 스택을 시작하고 대퇴골의 두께에 해당하는 총 심도 ~40mm입니다. 형광 신호 감지의 경우 나이퀴스트 샘플링과 일치하는 해상도로 이미지를 캡처합니다(8-10 μs/픽셀의 거주 설정이 있는 1024 x 1024 픽셀을 사용하고 있음). 신호 강도는 고전압 게인 설정을 조정하여 달성되는 선형 범위에 있어야 합니다. 실험 내의 일련의 샘플에 대한 게인 설정이 설정되면 샘플 간에 신호 강도를 비교할 수 있도록 변경해서는 안 됩니다. 시냅스 boutons 및 기타 세포 전체 구조를 이미징하기 위해 ≥60배율로 공초점 이미지를 캡처합니다. 검출기 설정은 선형 범위에 있어야 하며 픽셀 밀도, 거주 설정 및 z 깊이는 낮은 배율(단계 4.1)에서 캡처된 이미지와 유사해야 합니다.