認識された運動ニューロンの神経筋接合部における変化を検出する ショウジョウバエ 成脚の解剖と免疫染色

このプロトコルと組み合わせて使用される作業ソリューションを準備する手順は 、表 1 で説明されています。 試薬 準備 貯蔵 PBS 蒸留水に希釈して10xPBSストック溶液から1x PBSの作業ストックを作ります。 作業PBS在庫のpHは7.2- 7.4でなければなりません 細菌汚染が見えるまで1ヶ月以上4°C。 PBT 1x PBS溶液に0.1%非イオン性界面活性剤を使用。 細菌汚染が見えるまで1ヶ月以上4°C。 ファ 3.7%ホルムアルデヒド溶液は37%ホルムアルデヒドストックから作られ、1x PBSで希釈されています。 室温。解剖の毎日新鮮な作る 注意:37%のストック溶液として供給されたホルムアルデヒドは、潜在的な発がん性物質であり、ヒュームフードで希釈する必要があります。 5% NGS PBTで希釈した5%の正常なヤギ血清。 使用される血清は、使用する二次抗体の種と一致する必要があります。 細菌汚染が見えるまで、4°Cの数週間 表 1.成体ショウジョウバエ脚の免疫細胞化学を行うためのソリューション。 1. 組織の初期固定 各遺伝子型と年齢に約10ハエを選択します。二酸化炭素の下でフライパッドで麻酔をします(図1A、B)。注:解剖後に十分な大きさのサンプルサイズを確保するために、必要以上にハエを使用してください。 ペイントブラシを使用して、ハエをガラスウェルまたは皿に約30秒から1分間冷たいメタノールに移します(図1C)。メタノールは、カチカリン炭化水素を可溶化し、ハエは水溶液に浮かばすのではなく、水没させることができるようになりました。 鉗子で、慎重にPBSにハエを移す。氷冷PBSで3倍をすすぎ、余分なメタノールを取り除き、解剖と固定するまで氷上のPBSでハエを保ちます。この時点で、ハエを解剖し、可能な限り最短時間(<30分)以内に修正します。 脚を分離するには、冷たいPBSで満たされたシリコーンエラストマー解剖皿にハエを移し、#5デュモン鉗子の2組を使用してコクサのメタソシック脚を取り除くか、ヴァンナハサミで脚を切断します(図1D)。PBSの1 mLで満たされたプラスチック24ウェルプレートのウェルに脚を移し、すべての脚が取り除かれ、井戸に移されるまでプレートを氷の上に保ちます。注:各井戸は少なくとも20本の脚を保持することができます。 PBS溶液を1mLのFA溶液に交換し、ヌテタで30分間回転させます(図1E)。ヌテタの設定は、中速度(17 rpm)に設定する必要があります。脚が十分な固定のために、この時間の間にFA溶液に完全に沈められるようにしてください。 FA溶液を除去するには、PBS 3xの1mLで速やかに洗浄し、さらに3つの洗浄をそれぞれ1mLで5分間洗浄します。氷上のPBSの1mLで組織を氷上に保持し、以下に記載の解剖ステップ中に保持する。 2. 脚のキューティクルと抗体染色の除去 脚のキューティクルを取り外す 解剖鉗子は成功のために重要である。#5スーパーファイン鉗子の端にある両プロングにわずかな平行な曲げを導入し、キューティクルを突くのではなく表面的につかむことができるベベルを提供し、組織を台無しにすることができます(図1F、G)。メモ:平行に曲げた突起は、閉じたときに、プロングの長さ全体にわたって互いに接触する必要があります(図2)。 解剖のためにPBSのシリコーンエラストマー皿に足を移す。前側が上向きになるように脚を向けます(脚の解剖学と向きの情報については 図 3 を参照)。1組の鉗子を使用して、脛物セグメントをシリコーンエラストマー皿に対して保持する。ベベル側を下に保持した他の鉗子を使用して、大腿骨の遠位端にキューティクルの一部をつかみ、トロシャンターに向かって近位方向に引っ張ります。 大腿骨の近位端に裸の筋肉が見えるまで、系統的にキューティクルを取り除きます(図1F、G、H)。注:筋肉を引っ張らないように、鉗子の面前の側を使用して脚と表面的な接触をするだけです。 すべての脚を解剖したら、PBSをFAに置き換えて、中速でヌテーターで振って30分間脚を後固定します(図1I)。サンプルを1 mLのPBSで3回、PBTでそれぞれ5分間3回洗浄します(図1J)。注:モノクローナル抗体NC82(アンチブリュフパイロット)で染色して活性領域を標識する場合、この抗原はより長い固定に敏感であるため、20分間の後修正を行います。 図 2.大人の足を解剖するために使用される修正された鉗子。 (A)鉗子の端部は曲がり、その後、研ぎ石に出してベベルを作成する下部(矢印)で平らにされています。(B)対照的に、不変鉗子の突起は曲がっていない。スケールバー= 1 mm この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 抗体染色 抗体染色用の組織をブロックするには、PBTで希釈した5%NGSの1 mLからなるブロッキング溶液でPBTの1mLを交換してください。解剖した脚を室温で4時間、または4°Cで一晩、中速(17rpm)でヌテーターで揺れながらインキュベートします。すべてのインキュベーション中に、プラスチックカバーに加えてシールテープでウェルをカバーします(図1J)。注:24ウェルプレートは、マイクロ遠心チューブを使用する以前の試みは足の骨折や組織の損傷をもたらしたので、1.5 mLまたは2 mLマイクロ遠心分離機ではなく免疫細胞化学に使用されます。 ブロッキング溶液を除去し、新鮮なブロッキング溶液で希釈した一次抗体の300 mLを添加します。使用される抗体の少量は、組織をカバーするのに十分である必要があります。実験室の密封テープとプラスチック製の蓋でウェルを再密封し、中速でヌテーターで振る4°Cで一晩インキュベートします(図1J)。これらの研究に用いられる働く抗体試薬情報および濃度を 表2に記載する。 1 mL の PBT で一次抗体を 3 回短時間、3 回ずつ 15 分間洗浄します(図 1J)。注:希釈された一次抗体は、4°Cで最大2週間保存すると保存し、再利用することができます。 組織を室温で少なくとも2時間、または4Cで一晩、5%NGSの1mLで再びブロックする(図1J)。 5%NGSブロッキング溶液を取り外し、適切な希釈蛍光コンジュゲート二次抗体を300μL添加します。さらに、1:2000の蛍光結合ファロイジンを標識筋に加える(図1J)。 二次抗体インキュベーションの場合、実験室のシールテープと蓋付きのシールウェル。また、光からフッ素を保護するために、アルミ箔でプレートをラップします。室温で6〜8時間、または4°Cで一晩インキュベートする。 上記のステップ2.2.3に記載の2次抗体およびファロイジンを洗浄する。蛍光体を光から保護するために、打ち上げの間にアルミホイルでプレートをカバーします。 3. 脚の取り付け 鉗子を使用してスライドに足を移し、前部側を上に向けます。取り付け用メディアで脚を覆います(図1K、L)。注:切断された脚は、下の穴がカミソリの刃で切断することによって広がる場合、P1000ピペットチップで吸引することができます。 モデリング粘土の小さなボールにカバースリップコーナーを削り取ることによって、22×22 mm2 カバースリップ(#1.5厚さ)に粘土スペーサーを追加します。各コーナーには、厚さ1〜2mmの粘土が少量必要です(図1K)。 スライドを覆うために、粘土スペーサーをスライドに向けてカバースリップを追加し、カバースリップが大腿骨の表面に触れるまで慎重にコーナーを押します。 蒸発を防ぐために、カバースリップの端をマニキュアで密封し、暗い場所(約10分)で乾燥させてから、イメージングまで4°Cで保存します。 4. イメージング 共焦点顕微鏡による画像(図1M)。解剖の質をより良く評価するために透過光チャネルを含め、関心のある領域で目に見えて破壊された筋線維を有するサンプルは廃棄すべきである。 2倍のズームと、大腿骨の厚さに対応する〜40 mmの合計画像深度を持つ20倍の拡大でZスタックのイメージングを開始します。蛍光信号検出では、ナイキストサンプリングと一致する解像度で画像をキャプチャします(1024 x 1024ピクセル、8~10μs/ピクセルの位取り設定を使用)。信号強度は、高電圧ゲイン設定を調整することによって達成される線形範囲にあるべきです。実験内の一連のサンプルにゲイン設定を設定した後は、サンプル間で信号強度を比較できるように変更しないでください。 シナプス・ブトンやその他の細胞下構造をイメージングする場合は、≥60倍の倍率で共焦点画像をキャプチャします。検出器の設定は線形範囲にする必要がありますが、ピクセル密度、位取り設定、Z深度は、低倍率で撮影された画像に対して類似している必要があります(ステップ 4.1)。