果蝇成腿的解剖和免疫组织化学，以检测已识别运动神经元的神经肌肉接头处的变化

与该协议结合使用的制备工作溶液的程序在 表1中描述。 试剂 制备 存储 公共广播公司 通过在蒸馏水中稀释，从10倍PBS原液溶液中制作1x PBS的工作储备。 工作PBS储液的pH值应为7.2-7.4 4°C持续1个月以上，直到细菌污染可见。 断续器 1x PBS溶液，含0.1%非离子表面活性剂。 4°C持续1个月以上，直到细菌污染可见。 发 3.7%甲醛溶液由37%甲醛原液制成，并在1x PBS中稀释。 室温。每天进行清扫 注意：作为37%储备溶液提供的甲醛是一种潜在的致癌物质，应在通风橱中稀释。 5% 新糖核酸 5%正常山羊血清稀释在PBT中。 使用的血清应与要使用的二抗的种类相匹配。 4°C数周，直到细菌污染可见 表 1.用于对成年果蝇腿进行免疫细胞化学的解决方案。 1. 组织的初始固定 为每个基因型和年龄选择大约10只苍蝇。在二氧化碳下的苍蝇垫上麻醉（图1A，B）。注意：开始时要比必要的苍蝇多，以确保解剖后样本量足够大。 使用画笔，将苍蝇转移到玻璃孔或皿中的冷甲醇中约30秒至1分钟（图1C）。甲醇溶解角质层碳氢化合物，苍蝇现在可以被淹没而不是漂浮在水溶液中。 使用镊子，小心地将苍蝇转移到PBS。在冰冷的PBS中冲洗3次以除去多余的甲醇，并将苍蝇保持在PBS的冰上，直到解剖和固定。此时，解剖苍蝇并在尽可能短的时间内（<30分钟）固定。 为了隔离腿部，将苍蝇转移到装满冷PBS的硅胶弹性体解剖皿中，使用两对#5 Dumont镊子去除coxa处的中胸腿，或用Vanna剪刀切割腿部（图1D）。将支腿转移到充满1 mL PBS的塑料24孔板中的孔中，并将板保持在冰上，直到所有腿都被移除并转移到孔中。注意：每个井至少可以容纳20条腿。 用1 mL FA溶液替换PBS溶液，并在螺母器上旋转30分钟（图1E）。螺母器设置应设置为中速（17 rpm）。在此期间，确保支腿完全浸没在FA溶液中，以便充分固定。 要除去FA溶液，快速在1 mL PBS 3x中洗涤，然后在1 mL PBS中再洗涤3次，每次5分钟。在下述解剖步骤之前和期间，将组织保持在冰上的1 mL PBS中。 2. 去除腿部角质层和抗体染色 去除腿部角质层 解剖镊子是成功的关键。在#5超细镊子末端的两个爪子中引入轻微的平行弯曲，以提供一个斜面，允许角质层被表面抓住而不是戳，这可能会破坏组织（图1F，G）。注：闭合时，平行弯曲的插脚仍应在整个插脚长度上相互接触（图2）。 将支腿转移到PBS中的硅胶弹性体培养皿中进行解剖。调整腿部方向，使前侧朝上（有关腿部解剖学和方向信息，请参见 图3 ）。使用一对镊子，将胫骨段固定在硅胶弹性体皿上。使用其他镊子将斜面朝下，抓住股骨远端的角质层，然后向近端方向向大转子拉动。 保持有条不紊地去除角质层，直到整个股骨近端可见裸肌（图1F，G，H）。注意：仅使用镊子的斜面与腿部进行浅表接触，以避免拉扯肌肉。 解剖所有支腿后，用FA替换PBS，在固定支腿后以中速摇动螺母30分钟（图1I）。在1mL PBS中快速洗涤样品3次，然后在PBT中洗涤3次，每次5分钟（图1J）。注意：如果用单克隆抗体NC82（抗布鲁赫普氏仪）染色以标记活性区域，则在固定后20分钟，因为该抗原对较长时间的固定敏感。 图 2.用于解剖成人腿的改良镊子。 （A）镊子的末端弯曲，然后在底部（箭头）变平，通过在磨刀石上锉削形成斜面。（B）相比之下，未经修饰的镊子的爪子不弯曲。比例尺 = 1 mm 请单击此处查看此图的放大版本。 抗体染色 为了阻断组织以进行抗体染色，用由1 mL稀释在PBT中的5%NGS组成的封闭溶液代替1mL PBT。在室温下孵育解剖的腿4小时，或在4°C下过夜，同时以中速（17 rpm）在螺母上摇动。在所有孵育过程中，除了塑料盖外，还要用密封胶带盖住孔（图1J）。注意：24孔板用于免疫细胞化学，而不是1.5 mL或2 mL微量离心机，因为以前尝试使用微量离心管导致腿部骨折和组织受损。 除去封闭溶液，加入300mL在新鲜封闭溶液中稀释的一抗。使用的小体积抗体应足以覆盖组织。用实验室密封胶带和塑料盖重新密封孔，并在4°C下孵育过夜，并在螺母器上以中速振荡（图1J）。用于这些研究的工作抗体试剂信息和浓度如 表2所示。 在1mLPBT中短暂洗涤一抗3次，然后3次，每次15分钟（图1J）。注意：如果稀释的一抗在4°C下储存长达2周，则可以保存并重复使用。 在1mL 5%NGS中再次阻断组织，在室温下或4 C过夜至少2小时（图1J）。 除去5%NGS封闭溶液，加入300μL适当稀释的荧光偶联二抗。此外，加入 1 ： 2000 稀释的荧光偶联的蛋白以标记肌肉（ 图 1J ）。 对于二抗孵育，请使用实验室密封胶带和盖子密封孔。此外，用铝箔包裹板以保护荧光团免受光照。在室温下孵育6-8小时或在4°C下孵育过夜。 洗涤二抗和苷，如上述步骤 2 . 2 . 3 所述。在洗涤之间用铝箔盖板，以保护荧光团免受光照。 3. 安装腿 使用镊子将腿转移到载玻片上，并将前侧向上定向。用安装介质盖住支腿（图1K，L）。注意：如果用剃须刀片切割底部孔加宽，则可以使用P1000移液器吸头吸出解剖的支腿。 将粘土垫片添加到22×22 mm2 的盖玻片（#1.5厚度）中，方法是在建模粘土的小球上刮刮盖玻片角。每个角落应有少量1-2毫米厚的粘土（图1K）。 要覆盖滑轨，请添加盖玻片，将粘土垫片朝向载玻片，然后小心地推动角落，直到盖玻片刚好接触到股骨表面。 为了防止蒸发，用指甲油密封盖玻片的边缘，并在黑暗的地方（约10分钟）干燥，然后在4°C下储存直至成像。 4. 成像 通过共聚焦显微镜成像（图1M）。包括透射光通道以更好地评估解剖的质量，并且应丢弃在感兴趣区域具有明显破坏的肌肉纤维的样品。 开始成像z-stack，以20倍放大倍率，2倍变焦，总图像深度约为40毫米，对应于股骨的厚度。对于荧光信号检测，以与奈奎斯特采样一致的分辨率捕获图像（我们使用1024 x 1024像素，停留设置为8-10 μs /像素）。信号强度应在通过调整高电压增益设置实现的线性范围内。一旦为实验中的一系列样品设置了增益设置，就不应更改它们，以便可以比较样品之间的信号强度。 对于突触胸顿和其他亚细胞结构的成像，以≥60倍放大倍率捕获共聚焦图像。探测器设置应在线性范围内，而对于以较低放大倍率拍摄的图像，像素密度、停留设置和 z 深度应相似（步骤 4.1）。