Автоматизированная система культивирования для использования в доклиническом тестировании методов лечения туберкулеза, направленных на хозяина
Summary
Быстрая и эффективная количественная оценка внутриклеточного роста M. tuberculosis имеет решающее значение для проведения улучшенных методов лечения туберкулеза (ТБ). Этот протокол описывает колориметрический анализ обнаружения на основе бульона с использованием автоматизированной системы жидких культур для количественной оценки роста Mtb в макрофагах, обработанных терапией, направленной на хозяина.
Abstract
Микобактерия туберкулеза (Mtb), возбудитель туберкулеза (ТБ), была самой значительной причиной смерти от инфекционных заболеваний во всем мире до появления COVID-19. Mtb эволюционировал, чтобы сохраняться во внутриклеточной среде, уклоняться от защиты хозяина и развил устойчивость ко многим противотуберкулезным препаратам. Одним из подходов к решению проблемы резистентности является определение существующих одобренных препаратов, которые будут стимулировать иммунный ответ хозяина на Mtb. Затем эти препараты могут быть перепрофилированы в качестве дополнительных методов лечения, направленных на хозяина (HDT), чтобы сократить время лечения и помочь преодолеть устойчивость к антибиотикам.
Количественная оценка внутриклеточного роста Mtb в макрофагах является важным аспектом оценки потенциального HDT. Золотым стандартом для измерения роста Mtb является подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ) на агаровых пластинах. Это медленный, трудоемкий анализ, который не поддается быстрому скринингу лекарств. В этом протоколе автоматизированная система культивирования на основе бульона, которая чаще используется для обнаружения Mtb в клинических образцах, была адаптирована для доклинического скрининга терапии, направленной на хозяина. Оценивалась способность системы анализа жидких культур исследовать внутриклеточный рост Mtb в макрофагах, обработанных HDT. HDT, протестированные на их способность ингибировать рост Mtb, представляли собой полностью транс-ретиноевую кислоту (AtRA), как в растворе, так и инкапсулированную в микрочастицы поли(молочно-ко-гликолевой кислоты) (PLGA) и комбинацию интерферона-гамма и линезолида. Преимущества этого автоматизированного метода на основе жидких культур по сравнению с методом КОЕ включают простоту настройки, менее трудоемкую подготовку и более быстрое время получения результатов (5-12 дней по сравнению с 21 днем или более для агаровых пластин).
Introduction
Микобактерия туберкулеза (Mtb), возбудитель туберкулеза, была наиболее значимой причиной смерти от инфекционных заболеваний во всем мире в 2019году 1. Чтобы уклониться от защиты хозяина, Mtb подрывает микобактерицидную активность врожденных иммунных клеток, таких как макрофаги и дендритные клетки (DC), позволяя ему сохраняться внутриклеточным образом иреплицироваться 2. Отсутствие эффективной вакцины для профилактики туберкулеза легких у взрослых и растущее появление лекарственно-устойчивых штаммов подчеркивают настоятельную необходимость в новых методах лечения.
Адъюнктивная терапия, направленная на хозяина (HDT), может сократить время лечения и помочь преодолеть резистентность3. Доклиническая оценка кандидатов HDT in vitro для определения микобактерицидной активности в макрофагах часто опирается на количественную оценку роста Mtb по колониеобразующим единицам (КОЕ) на твердых агаровых пластинах. Это медленный, трудоемкий анализ, который не поддается быстрому скринингу лекарств. Коммерчески доступные автоматизированные системы обнаружения микробов на основе бульона чаще используются в клинических микробиологических лабораториях для обнаружения и тестирования чувствительности к лекарственным средствам Mtb и других видов микобактерий в клинических образцах4. Эти приборы измеряют рост косвенно на основе бактериальной метаболической активности, приводящей к физическим изменениям в культуральной среде (изменение уровней CO2 илиO2 или давления), контролируемых с течением времени5. Считывание – это время до позитивности (TPP), которое, как было ранее показано, коррелирует с Mtb КОЕ в образцах мокроты больных туберкулезом в ответ на лечение 6,7 и в лизатах инфицированных мышных легких и селезенки8. Кроме того, системы обнаружения жидких культур были использованы для измерения влияния традиционной терапии, направленной на патогены, на рост микобактерий в аксенической культуре и культивируемых макрофагах 9,10. Инструмент также использовался для исследования врожденной способности дендритных клеток и альвеолярных макрофагов контролировать внутриклеточный рост Mtb 11,12. Этот экспериментальный протокол демонстрирует, что система диагностики жидких культур может быть адаптирована для выполнения доклинического скрининга HDT на туберкулез в культивируемых макрофагах. По сравнению с перечислением КОЕ, основным преимуществом этого метода является то, что он значительно сокращает экспериментальный труд и время, необходимое для количественной оценки внутриклеточного роста / выживаемости микобактерий. Этот метод опирается на доступ к автоматизированному инструменту культивирования, который может быть использован для оценки внутриклеточной выживаемости микобактерий в иммунных клетках, обработанных широким спектром фармакологических реагентов, нацеленных на клеточные функции для повышения иммунитета хозяина.
Protocol
Representative Results
Discussion
Авторы использовали метод жидкой культуры, описанный в этом протоколе, для мониторинга роста Mtb в моноцитарных макрофагах и альвеолярных макрофагах и клетках THP-1, дифференцированных с PMA 11,16,17. Этот метод также может быть модифицирован ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Научным фондом Ирландии (SFI 08/RFP/BMT1689), Советом по исследованиям в области здравоохранения в Ирландии [HRA-POR/2012/4 и HRA-POR-2015-1145] и Королевским городским больничным фондом Дублина.
Materials
| IX51 Fluorescent Microscope | Olympus, Japan | N/A | AFB detection and imaging |
| 2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | Mtb infection of macropahges |
| 5 mL syringe, Luer lock | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | Mtb infection of macropahges/CFU |
| 50 mL tube, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | Mtb infection of macropahges |
| all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | Host directed therapy candidate |
| BacT/ALERT 3D Microbial Detection System | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 247001 | Broth-based colormetric detection system |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP Nutrient Supplement | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 414997 | Broth-based colormetric detection assay |
| BACT/ALERT MP culture bottles | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 419744 | Broth-based colormetric detection assay |
| BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | Mycobacterium liquid culture |
| BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | Colony Forming Units |
| Cell scraper, 25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | Harvest of lmacrophage lysates |
| Corning Syringe Filter, 0.2 µm | Corning Incorporated, Germany | 431219 | Sterilization of lysis buffer |
| Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness | VWR International Limited | 631 – 0147 | |
| Cycloheximide, from microbial | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | Colony Forming Units |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | Antifade mounting medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | Mtb infection of macropahges |
| Fetal Bovine Serum, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | Macrophage cell culture |
| Glycerol, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | Colony Forming Units |
| Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | Nuclear stain |
| IFNγ, recombinant human | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | Host directed therapy candidate |
| Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | Mtb infection of macropahges |
| L-Asparagine, anhydrous | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | Colony Forming Units |
| Linezolid | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | Antibiotic |
| Microlance Hypodermic Needle 25 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | Mtb infection of macropahges/CFU |
| Middlebrook 7H10 Agar Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | Colony Forming Units |
| Middlebrook 7H9 Broth Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | Mycobacterium liquid culture |
| Modified Auramine O Stain and Decolourizer | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | AFB stain |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | Mtb infection of macropahges |
| Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag) | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | Colony Forming Units |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | Macrophage cell culture |
| Polysorbate 80, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | Mycobacterium liquid culture |
| RPMI-1640, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | Macrophage cell culture |
| Sterile Cell Spreader, L-Shaped | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | Colony Forming Units |
| T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | Mycobacterium liquid culture |
| THP-1 cell line | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | Macrophage cell culture |
Referencias
- WHO. Global Tuberculosis Report. World Health Organization. , (2020).
- Russell, D. G. Mycobacterium tuberculosis and the intimate discourse of a chronic infection. Immunological Reviews. 240 (1), 252-268 (2011).
- Young, C., Walzl, G., Du Plessis, N. Therapeutic host-directed strategies to improve outcome in tuberculosis. Mucosal Immunology. 13 (2), 190-204 (2020).
- Angeby, K. A., et al. Evaluation of the BacT/ALERT 3D system for recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Clinical Microbiology and Infection. 9 (11), 1148-1152 (2003).
- Asmar, S., Drancourt, M. Rapid culture-based diagnosis of pulmonary tuberculosis in developed and developing countries. Frontiers in Microbiology. 6, 1184 (2015).
- Diacon, A. H., et al. Time to liquid culture positivity can substitute for colony counting on agar plates in early bactericidal activity studies of antituberculosis agents. Clinical Microbiology and Infection. 18 (7), 711-717 (2012).
- Diacon, A. H., et al. Time to positivity in liquid culture predicts colony forming unit counts of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens. Tuberculosis. 94 (2), 148-151 (2014).
- O’Sullivan, D. M., et al. Evaluation of liquid culture for quantitation of Mycobacterium tuberculosis in murine models. Vaccine. 25 (49), 8203-8205 (2007).
- Heinrichs, M., et al. Mycobacterium tuberculosis Strains H37ra and H37rv have equivalent minimum inhibitory concentrations to most antituberculosis drugs. International Journal of Mycobacteriology. 7 (2), 156-161 (2018).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (1), 640-645 (2016).
- O’Leary, S. M., et al. Cigarette smoking impairs human pulmonary immunity to Mycobacterium tuberculosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (12), 1430-1436 (2014).
- Ryan, R. C., O’Sullivan, M. P., Keane, J. Mycobacterium tuberculosis infection induces non-apoptotic cell death of human dendritic cells. BMC Microbiology. 11, 237 (2011).
- Keane, J., Remold, H. G., Kornfeld, H. Virulent mycobacterium tuberculosis strains evade apoptosis of infected alveolar macrophages. The Journal of Immunology. 164 (4), 2016-2020 (2000).
- Gao, X. F., Yang, Z. W., Li, J. Adjunctive therapy with interferon-gamma for the treatment of pulmonary tuberculosis: a systematic review. International Journal of Infectious Diseases. 15 (9), 594-600 (2011).
- Thorpe, T. C., et al. BacT/Alert: an automated colorimetric microbial detection system. Journal of Clinical Microbiology. 28 (7), 1608-1612 (1990).
- Gleeson, L. E., et al. Cutting edge: Mycobacterium tuberculosis induces aerobic glycolysis in human alveolar macrophages that is required for control of intracellular bacillary replication. The Journal of Immunology. 196 (6), 2444-2449 (2016).
- O’Connor, G., et al. Inhalable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles encapsulating all-trans-Retinoic acid (ATRA) as a host-directed, adjunctive treatment for Mycobacterium tuberculosis infection. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 134, 153-165 (2019).
- O’Connor, G., et al. Sharpening nature’s tools for efficient tuberculosis control: A review of the potential role and development of host-directed therapies and strategies for targeted respiratory delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 102, 33-54 (2016).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Ortalo-Magne, A., et al. Molecular composition of the outermost capsular material of the tubercle bacillus. Microbiology. 141, 1609-1620 (1995).
- Stokes, R. W., et al. The glycan-rich outer layer of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis acts as an antiphagocytic capsule limiting the association of the bacterium with macrophages. Infection and Immunity. 72 (10), 5676-5686 (2004).
- O’Sullivan, M. P., O’Leary, S., Kelly, D. M., Keane, J. A caspase-independent pathway mediates macrophage cell death in response to Mycobacterium tuberculosis infection. Infection and Immunity. 75 (4), 1984-1993 (2007).
- Cheon, S. H., et al. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 901-907 (2002).
- Nathan, C., Barry, C. E. TB drug development: immunology at the table. Immunological Reviews. 264 (1), 308-318 (2015).
- Bowness, R., et al. The relationship between Mycobacterium tuberculosis MGIT time to positivity and cfu in sputum samples demonstrates changing bacterial phenotypes potentially reflecting the impact of chemotherapy on critical sub-populations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (2), 448-455 (2015).
- Basu Roy, R., et al. An auto-luminescent fluorescent BCG whole blood assay to enable evaluation of paediatric mycobacterial responses using minimal blood volumes. Frontiers in Pediatrics. 7, 151 (2019).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2′ epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000645 (2009).
- Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 92 (6), 453-488 (2012).
