Användarvänlig, hög genomströmning och helautomatisk dataförvärvsprogramvara för cryoelektronmikroskopi med en partikel
Summary
Enpartikel kryoelektronmikroskopi kräver ett lämpligt programvarupaket och användarvänlig pipeline för automatisk datainsamling med hög genomströmning. Här presenterar vi tillämpningen av ett helt automatiserat programpaket för bildförvärv, Latitude-S, och en praktisk pipeline för datainsamling av vitrifierade biomolekyler under lågdosförhållanden.
Abstract
Under de senaste åren har tekniska och metodologiska framsteg inom enpartikel kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) banat en ny väg för högupplöst strukturbestämning av biologiska makromolekyler. Trots de anmärkningsvärda framstegen inom kryo-EM finns det fortfarande utrymme för förbättringar i olika aspekter av arbetsflödet för enpartikelanalys. Enpartikelanalys kräver ett lämpligt programvarupaket för automatisk datainsamling med hög genomströmning. Flera automatiska mjukvarupaket för datainsamling har utvecklats för automatisk avbildning för enpartikel cryo-EM under de senaste åtta åren. Detta dokument presenterar en tillämpning av en helautomatisk bild förvärv pipeline för vitrified biomolecules under låg dos villkor.
Det visar ett mjukvarupaket, som kan samla in cryo-EM-data helt, automatiskt och exakt. Dessutom styrs olika mikroskopiska parametrar enkelt av detta programvarupaket. Detta protokoll visar potentialen i detta mjukvarupaket i automatiserad avbildning av allvarliga akut respiratorisk syndrom-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spik protein med en 200 keV cryo-elektronmikroskop utrustad med en direkt elektrondetektor (DED). Omkring 3 000 cryo-EM-filmbilder förvärvades i en enda session (48 h) av datainsamling, vilket ger en atomupplösningsstruktur av spikproteinet sars-cov-2. Dessutom visar denna strukturella studie att spikproteinet antar två stora konformationer, 1-RBD (receptorbindande domän) öppet och alla RBD-nedlagda konformationer.
Introduction
Single-particle cryo-EM har blivit en vanlig strukturell biologi teknik för högupplöst struktur bestämning av biologiska makromolekyler1. Enpartikelrekonstruktion är beroende av att förvärva ett stort antal mikrografer av vitrifierade prover för att extrahera tvådimensionella (2D) partikelbilder, som sedan används för att rekonstruera en tredimensionell (3D) struktur av en biologisk makromolekylär2,3. Före utvecklingen av DEDs varierade den resolution som uppnåddes från en partikelrekonstruktion mellan 4 och 30 Å4,5. Nyligen har den uppnåeliga upplösningen från enpartikel cryo-EM nått över 1,8 Å6. DED och automatiserad programvara för datainsamling har varit viktiga bidragsgivare till denna upplösningsrevolution7, där mänsklig intervention för datainsamling är minimal. I allmänhet utförs cryo-EM-avbildning vid låga elektrondoshastigheter (20-100 e/Å2) för att minimera elektronstråleinducerad strålningsskada hos biologiska prover, vilket bidrar till det låga signal-till-brus-förhållandet (SNR) i bilden. Denna låga SNR hindrar karakteriseringen av högupplösta strukturer av biologiska makromolekyler med hjälp av enpartikelanalys.
Den nya generationens elektrondetektorer är CMOS-baserade detektorer (complementary metal-oxide-semiconductor), som kan övervinna dessa låga SNR-relaterade hinder. Dessa direktdetekterings-CMOS-kameror möjliggör snabb avläsning av signalen, på grund av vilken kameran bidrar till bättre punktspridningsfunktion, lämplig SNR och utmärkt detektiv kvanteffektivitet (DQE) för biologiska makromolekyler. Direktdetekteringskameror erbjuder hög SNR8 och lågt brus i de inspelade bilderna, vilket resulterar i en kvantitativ ökning av detektivens kvanteffektivitet (DQE) – ett mått på hur mycket brus en detektor lägger till en bild. Dessa kameror spelar också in filmer med en hastighet av hundratals bilder per sekund, vilket möjliggör snabb datainsamling9,10. Alla dessa egenskaper gör snabba direktdetekteringskameror lämpliga för lågdostillämpningar.
Rörelsekorrigerade stackbilder används för databehandling för att beräkna 2D-klassificering och rekonstruera en 3D-densitetskarta över makromolekyler med hjälp av olika programvarupaket som RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 och EMAN215. För en partikelanalys krävs dock en enorm datauppsättning för att uppnå en högupplöst struktur. Därför är automatiska dataförvärvstullar mycket viktiga för datainsamling. För att spela in stora cryo-EM-datauppsättningar har flera programvarupaket använts under det senaste decenniet. Dedikerade programvarupaket, såsom AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS och EPU, har utvecklats för automatiserat datainsamling.
Dessa programvarupaket använder rutinuppgifter för att hitta hålpositioner automatiskt genom att korrelera lågförstoringsbilderna till bilder med hög förstoring, vilket hjälper till att identifiera hål med glaskroppsis av appropriativ istjocklek för bildförvärv under lågdosförhållanden. Dessa programvarupaket har minskat antalet repetitiva uppgifter och ökat genomströmningen för kryo-EM-datainsamlingen genom att förvärva en stor mängd högkvalitativa data under flera dagar kontinuerligt, utan avbrott och operatörens fysiska närvaro. Latitude-S är ett liknande mjukvarupaket som används för automatisk datainsamling för enpartikelanalys. Detta programvarupaket är dock endast lämpligt för K2/ K3-DED och är försett med dessa detektorer.
Detta protokoll visar potentialen hos Latitude-S i det automatiserade bildförvärvet av SARS-CoV-2 spike protein med en direkt elektrondetektor utrustad med en 200 keV cryo-EM (se tabellen över material). Med hjälp av detta datainsamlingsverktyg förvärvas 3 000 filmfiler av SARS-CoV-2 spike protein automatiskt, och ytterligare databehandling utförs för att erhålla en 3,9-4,4 Å upplösning spik proteinstruktur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Latitude-S är ett intuitivt användargränssnitt som ger en miljö för att automatiskt konfigurera och samla in tusentals högupplösta mikrografer eller filmfiler på två dagar. Det ger enkel navigering över rutnäten och bibehåller positionen för mikroskopsteget medan det går från låg förstoring till hög förstoring. Varje steg i datainsamlingen med Latitude-S är tidseffektivt, med funktioner som ett enkelt användargränssnitt, snabb direktuppspelning av data med upp till 4,5 GB/s hastighet och samtidig vi…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi uppmärksammar Institutionen för bioteknik, Institutionen för vetenskap och teknik (DST) och vetenskap, och ministeriet för utveckling av mänskliga resurser (MHRD), Indien, för finansiering och kryo-EM-anläggningen vid IISc-Bangalore. Vi bekräftar DBT-BUILDER Program (BT/INF/22/SP22844/2017) och DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) för National Cryo-EM-anläggningen på IISc, Bangalore. Vi bekräftar ekonomiskt stöd från Vetenskaps- och ingenjörsforskningsnämnden (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 och SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Vi tackar Ms. Ishika Pramanick för att ha förberett cryo-EM-rutnät, kryo-EM datainsamling och förberedelse av materialförteckningen. Vi tackar också Suman Mishra för bildbehandlingen av kryo-EM och för att han hjälpte oss att förbereda siffrorna. Vi tackar prof. Raghavan Varadarajan för att hjälpa oss att få det renade spikproteinprovet för denna studie.
Materials
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
Referencias
- Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
- Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
- Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
- Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
- Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
- McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
- Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
- Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
- Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
- Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy – TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
- Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
- Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, 384-389 (2007).
- Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
- Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
- Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
- Hillen, H. S., et al. Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).
- Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
- Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
- Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).
