Удобное, высокопроизводительное и полностью автоматизированное программное обеспечение для сбора данных для одночастичной криоэлектронной микроскопии
Summary
Одночастичная криоэлектронная микроскопия требует подходящего программного пакета и удобного для пользователя конвейера для автоматического сбора данных с высокой пропускной способностью. Здесь мы представляем применение полностью автоматизированного программного пакета для сбора изображений Latitude-S и практического конвейера для сбора данных остекленных биомолекул в условиях низких доз.
Abstract
За последние несколько лет технологические и методологические достижения в области криоэлектронной микроскопии с одной частицей (крио-ЭМ) проложили новый путь для определения структуры биологических макромолекул с высоким разрешением. Несмотря на значительные достижения в области крио-ЭМ, все еще есть возможности для улучшения различных аспектов рабочего процесса анализа одной частицы. Для анализа одной частиц требуется подходящий программный пакет для автоматического сбора данных с высокой пропускной способностью. За последние восемь лет было разработано несколько пакетов программного обеспечения для автоматического сбора данных для автоматической визуализации крио-ЭМ с одной частицей. В данной статье представлено применение полностью автоматизированного конвейера сбора изображений для остеклованных биомолекул в условиях низких доз.
Он демонстрирует программный пакет, который может собирать крио-EM данные полностью, автоматически и точно. Кроме того, различные микроскопические параметры легко контролируются этим программным пакетом. Этот протокол демонстрирует потенциал этого программного пакета в автоматизированной визуализации спайкового белка тяжелого острого респираторного синдрома-коронавируса 2 (SARS-CoV-2) с помощью криоэлектронного микроскопа 200 кэВ, оснащенного прямым электронным детектором (DED). За один сеанс (48 ч) сбора данных было получено около 3000 крио-ЭМ-изображений фильмов, что дало структуру с атомным разрешением спайкового белка SARS-CoV-2. Кроме того, это структурное исследование показывает, что спайковый белок принимает две основные конформации: 1-RBD (рецептор-связывающий домен) вверх открытым и все RBD вниз закрытые конформации.
Introduction
Крио-ЭМ с одной частицей стал основным методом структурной биологии для определения структуры биологических макромолекул с высоким разрешением1. Реконструкция одной частицы зависит от получения огромного количества микроснимков остеклованных образцов для извлечения двумерных (2D) изображений частиц, которые затем используются для реконструкции трехмерной (3D) структуры биологической макромолекулы2,3. До разработки DED разрешение, достигнутое при реконструкции одной частицы, варьировалось от 4 до 30 Å4,5. В последнее время достижимое разрешение от крио-ЭМ с одной частицей превысило 1,8 Å6. DED и автоматизированное программное обеспечение для сбора данных внесли основной вклад в эту революцию резолюции7, где вмешательство человека в сбор данных минимально. Как правило, крио-ЭМ-визуализация выполняется при низких мощностях дозы электронов (20-100 e/Å2) для минимизации электронно-лучевого радиационного повреждения биологических образцов, что способствует низкому соотношению сигнал/шум (SNR) на изображении. Этот низкий SNR препятствует характеристике структур с высоким разрешением биологических макромолекул с использованием анализа одиночных частиц.
Электронное детекторы нового поколения представляют собой кмОП-детекторы на основе КМОП (комплементарные металл-оксид-полупроводники), которые могут преодолевать эти препятствия, связанные с низким SNR. Эти КМОП-камеры с прямым обнаружением обеспечивают быстрое считывание сигнала, благодаря чему камера обеспечивает лучшую функцию точечного распространения, подходящую SNR и отличную детективную квантовую эффективность (DQE) для биологических макромолекул. Камеры прямого обнаружения обеспечивают высокий SNR8 и низкий уровень шума в записанных изображениях, что приводит к количественному увеличению квантовой эффективности детектива (DQE) – меры того, сколько шума детектор добавляет к изображению. Эти камеры также записывают фильмы со скоростью сотни кадров в секунду, что позволяет быстро собирать данные9,10. Все эти характеристики делают камеры быстрого прямого обнаружения пригодными для применения в низких дозах.
Стековые изображения с коррекцией движения используются для обработки данных для расчета 2D-классификации и реконструкции 3D-карты плотности макромолекул с помощью различных программных пакетов, таких как RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 и EMAN215. Однако для анализа одной частицы требуется огромный набор данных для достижения структуры с высоким разрешением. Поэтому плата за автоматический сбор данных имеет большое значение для сбора данных. Для записи больших наборов крио-ЭМ данных за последнее десятилетие было использовано несколько программных пакетов. Для автоматизированного сбора данных были разработаны специальные программные пакеты, такие как AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS и EPU.
Эти программные пакеты используют рутинные задачи для автоматического поиска положений отверстий путем корреляции изображений с низким увеличением с изображениями с высоким увеличением, что помогает идентифицировать отверстия со стекловидным льдом соответствующей толщины льда для получения изображений в условиях низкой дозы. Эти программные пакеты сократили количество повторяющихся задач и увеличили пропускную способность сбора крио-ЭМ данных за счет получения огромного количества высококачественных данных в течение нескольких дней непрерывно, без каких-либо перерывов и физического присутствия оператора. Latitude-S – это аналогичный программный пакет, который используется для автоматического сбора данных для анализа одиночных частиц. Однако этот программный пакет подходит только для DED K2/K3 и поставляется с этими детекторами.
Этот протокол демонстрирует потенциал Latitude-S в автоматизированном получении изображений спайкового белка SARS-CoV-2 с помощью прямого электронного детектора, оснащенного крио-ЭМ 200 кэВ (см. Таблицу материалов). С помощью этого инструмента сбора данных автоматически получают 3000 файлов фильмов спайкового белка SARS-CoV-2, и проводится дальнейшая обработка данных для получения структуры спайкового белка с разрешением 3,9-4,4 Å.
Protocol
Representative Results
Discussion
Latitude-S — это интуитивно понятный пользовательский интерфейс, который обеспечивает среду для автоматической настройки и сбора тысяч микроснимков высокого разрешения или файлов фильмов за два дня. Он обеспечивает легкую навигацию по сеткам и поддерживает положение ступени микроскопа, …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы выражаем признательность Департаменту биотехнологии, Департаменту науки и техники (DST) и науки, а также Министерству развития людских ресурсов (MHRD), Индия, за финансирование и крио-ЭМ-объект в IISc-Бангалоре. Мы принимаем участие в программе DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) и DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) для Национального крио-ЭМ-объекта в IISc, Бангалор. Мы выражаем финансовую поддержку со стороны Совета по научным и инженерным исследованиям (SERB) (грант No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 и SERB-IPA/2020/000094), DBT (Грант No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Мы благодарим г-жу Исику Праманик за подготовку крио-ЭМ-сетей, сбор крио-ЭМ данных и подготовку Таблицы материалов. Мы также благодарим г-на Сумана Мишру за крио-ЭМ обработку изображений и за помощь в подготовке рисунков. Мы благодарим профессора Рагхавана Варадараджана за помощь в получении очищенного образца спайкового белка для этого исследования.
Materials
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
Referencias
- Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
- Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
- Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
- Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
- Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
- McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
- Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
- Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
- Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
- Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy – TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
- Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
- Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, 384-389 (2007).
- Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
- Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
- Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
- Hillen, H. S., et al. Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).
- Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
- Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
- Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).
