단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 사용자 친화적이고 높은 처리량 및 완전 자동화된 데이터 수집 소프트웨어
Summary
단일 입자 냉동 전자 현미경 검사법은 고처리량 자동 데이터 수집을 위한 적합한 소프트웨어 패키지 및 사용자 친화적인 파이프라인을 요구합니다. 여기서는 완전 자동화된 이미지 수집 소프트웨어 패키지인 Latitude-S의 적용과 저용량 조건에서 유리화된 생체 분자의 데이터 수집을 위한 실용적인 파이프라인을 소개합니다.
Abstract
지난 몇 년 동안 단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법 (cryo-EM)의 기술적 및 방법론적 발전은 생물학적 거대 분자의 고해상도 구조 측정을위한 새로운 길을 열었습니다. 저저온-EM의 놀라운 발전에도 불구하고 단일 입자 분석 워크플로우의 다양한 측면에서 여전히 개선범위가 남아 있습니다. 단일 입자 분석은 고처리량 자동 데이터 수집을 위한 적합한 소프트웨어 패키지를 요구합니다. 지난 8년 동안 단일 입자 저저온-EM용 자동 이미징을 위해 여러 개의 자동 데이터 수집 소프트웨어 패키지가 개발되었습니다. 이 논문은 저용량 조건하에서 생체 분자를 생체화하기 위한 완전 자동화된 이미지 수집 파이프라인의 적용을 제시합니다.
cryo-EM 데이터를 완전하고 자동으로 정확하게 수집할 수 있는 소프트웨어 패키지를 보여 줍니다. 또한 이 소프트웨어 패키지에 의해 다양한 미세 한 매개 변수를 쉽게 제어 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 직접 전자 검출기 (DED)가 장착 된 200 keV 극저온 전자 현미경을 갖춘 중증 급성 호흡기 증후군 -코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 자동화 된 이미징에서이 소프트웨어 패키지의 잠재력을 보여줍니다. 약 3,000개의 극저온-EM 영화 이미지가 단일 세션(48h)의 데이터 수집에서 획득되어 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 원자 분해능 구조를 산출했습니다. 더욱이, 이러한 구조 연구는 스파이크 단백질이 두 가지 주요 적합성, 1-RBD(수용체 결합 도메인)를 열어 놓고 모든 RBD를 폐쇄된 적합성을 채택한다는 것을 나타낸다.
Introduction
단일 입자 저온 -EM은 생물학적 거대 분자1의 고해상도 구조 측정을위한 주류 구조 생물학 기술이되었다. 단일 입자 재구성은 생물학적 거대 분자2,3의 3차원 (3D) 구조를 재구성하는 데 사용되는 2차원 (2D) 입자 이미지를 추출하기 위해 유리화 된 샘플의 광대 한 수의 현미경 그래프를 획득하는 데 달려 있습니다. DED를 개발하기 전에 단일 입자 재구성에서 달성된 해상도는 4에서 30 Å4,5 사이로 다양했습니다. 최근에는 단일 입자 저온-EM의 달성 가능한 해상도가 1.8 Å6을 넘어왔습니다. DED 및 자동화된 데이터 수집 소프트웨어는 데이터 수집에 대한 인간의 개입이 최소화된 이 해상도 revolution7에 주요 기여를 했습니다. 일반적으로, 저온-EM 이미징은 저전자 용량 율(20-100 e/Å2)에서 수행되어 생물학적 샘플의 전자 빔 유도 방사선 손상을 최소화하며, 이는 이미지내 낮은 신호 대 잡음 비(SNR)에 기여한다. 이 낮은 SNR은 단일 입자 분석을 사용하여 생물학적 거대 분자의 고해상도 구조의 특성화를 방해합니다.
차세대 전자 검출기는 CMOS(상보금속-산화물-반도체) 기반 검출기로, 이러한 낮은 SNR 관련 장애물을 극복할 수 있습니다. 이러한 직접 감지 CMOS 카메라는 카메라가 생물학적 거대 분자에 대한 더 나은 포인트 확산 기능, 적합한 SNR 및 우수한 탐정 양자 효율(DQE)에 기여하기 때문에 신호를 빠르게 판독할 수 있습니다. 직접 감지 카메라는 기록된 이미지에서 높은 SNR8 및 낮은 노이즈를 제공하므로 검출기가 이미지에 추가되는 소음의 양을 측정하는 DQE(형사 양자 효율)의 정량적 증가가 발생합니다. 이 카메라는 초당 수백 프레임의 속도로 영화를 기록하여 빠른 데이터 수집9,10을 가능하게 합니다. 이러한 모든 특성은 빠른 직접 감지 카메라를 저용량 응용 분야에 적합하게 만듭니다.
동작 보정 스택 이미지는 RELION11, FREALIGN12, 극저온SPARC13, 시스템14 및 EMAN215와 같은 다양한 소프트웨어 패키지를 사용하여 2D 분류를 계산하고 거대 분자의 3D 밀도 맵을 재구성하는 데 데이터 처리에 사용됩니다. 그러나 단일 입자 해석의 경우 고해상도 구조를 달성하기 위해서는 엄청난 데이터 집합이 필요합니다. 따라서 자동 데이터 수집 통행료는 데이터 수집에 매우 필수적입니다. 대규모 cryo-EM 데이터 세트를 기록하기 위해 지난 10년 동안 여러 소프트웨어 패키지가 사용되었습니다. AutoEM16, AutoEMation17, 레기논18, 시리얼EM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS 및 EPU와 같은 전용 소프트웨어 패키지가 자동화된 데이터 수집을 위해 개발되었습니다.
이 소프트웨어 패키지는 저배율 이미지를 고배율 이미지와 상호 연결하여 자동으로 구멍 위치를 찾기 위해 일상적인 작업을 사용하여 저용량 조건에서 이미지 수집을 위한 유리체 얼음 두께의 구멍을 식별하는 데 도움을 주습니다. 이러한 소프트웨어 패키지는 작업자의 중단 및 물리적 존재 없이 며칠 동안 엄청난 양의 양질의 데이터를 지속적으로 수집하여 반복적인 작업 수를 줄이고 cryo-EM 데이터 수집의 처리량을 증가시켰습니다. Latitude-S는 단일 입자 분석을 위해 자동 데이터 수집에 사용되는 유사한 소프트웨어 패키지입니다. 그러나 이 소프트웨어 패키지는 K2/K3 DED에만 적합하며 이러한 검출기와 함께 제공됩니다.
이 프로토콜은 200 keV 극저온-EM을 장착한 직접 전자 검출기로 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 자동화된 이미지 획득에서 위도-S의 잠재력을 보여줍니다( 재료표 참조). 이 데이터 수집 도구를 사용하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 3,000개의 영화 파일이 자동으로 획득되고, 추가 데이터 처리는 3.9-4.4 Å 해상도 스파이크 단백질 구조를 얻기 위해 수행됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Latitude-S는 직관적인 사용자 인터페이스로, 이틀 만에 수천 개의 고해상도 현미경 또는 영화 파일을 자동으로 설정하고 수집할 수 있는 환경을 제공합니다. 그리드 를 가로 질러 쉽게 탐색할 수 있으며 낮은 배율에서 높은 배율로 이동하는 동안 현미경 단계의 위치를 유지합니다. Latitude-S를 사용하여 데이터 수집의 각 단계는 시간 효율적이며 간단한 사용자 인터페이스, 최대 4.5GB/s 속도로 데이터?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 생명공학부, 과학기술부(DST) 및 과학기술부, 인도 인사개발부(MHRD) 및 IISc-방갈로르의 냉동 EM 시설에 대한 지원을 인정합니다. 우리는 DBT 빌더 프로그램 (BT / INF / 22 / SP22844/2017) 및 DST-FIST (SR / FST / LSII-039/2015) IISc, 방갈로르에있는 국립 Cryo-EM 시설에 대한 인정. 우리는 과학 공학 연구 위원회 (SERB)(보조금 No.SB / S2 / RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 및 SERB-IPA/2020/000094), DBT (그랜트 번호)의 재정 지원을 인정합니다. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). 극저온-EM 그리드를 준비하고, 냉동 EM 데이터 수집을 준비하고, 재료 테이블을 준비해 주신 이시카 프라마닉 씨께 감사드립니다. 또한, 스만 미쉬라 씨가 저온-EM 이미지 처리와 수치를 준비할 수 있도록 도와준 것에 대해 서도 감사드립니다. 우리는 이 연구를 위한 정제된 스파이크 단백질 견본을 얻기 위하여 저희를 돕는 라가반 바라다얀 교수에게 감사드립니다.
Materials
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
Referencias
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