Brugervenlig, høj-throughput, og fuldautomatisk dataindsamling software til single-partikel Cryo-elektron Mikroskopi

Single-partikel cryo-EM er blevet en mainstream strukturel biologi teknik til høj opløsning struktur bestemmelse af biologiske ^{makromolekyler1}. Enkeltpartikelrekonstruktion afhænger af erhvervelse af et stort antal mikrografer af vitrified prøver til at udtrække todimensionelle (2D) partikelbilleder, som derefter bruges til at rekonstruere en tredimensionel (3D) struktur af en biologisk ^{makromolekyle2,3}. Før udviklingen af DED’er varierede opløsningen opnået fra enkeltpartikelrekonstruktion mellem 4 og 30 ^Å4,5. For nylig har den opnåelige opløsning fra enkelt-partikel cryo-EM nået ud over 1,8 ^Å6. DED og automatiseret dataindsamling software har været store bidragydere til denne opløsning ^revolution7, hvor menneskelig intervention for dataindsamling er minimal. Generelt udføres cryo-EM-billeddannelse ved lave elektrondosishastigheder (20-100 e/^Å2) for at minimere elektronstråleinduceret strålingsskader af biologiske prøver, hvilket bidrager til det lave signal-til-støj-forhold (SNR) i billedet. Denne lave SNR hindrer karakteriseringen af de høje opløsningsstrukturer af biologiske makromolekyler ved hjælp af enkeltpartikelanalyse.

Den nye generation elektrondetektorer er CMOS (komplementære metal-oxid-halvleder)-baserede detektorer, som kan overvinde disse lave SNR-relaterede forhindringer. Disse CMOS-kameraer til direkte detektion giver mulighed for hurtig udlæsning af signalet, som kameraet bidrager med bedre punktspredningsfunktion, passende SNR og fremragende detektivkvanteeffektivitet (DQE) til biologiske makromolekyler. Direkte detektionskameraer tilbyder høj SNR8 og lav støj i de optagede billeder, hvilket resulterer i en kvantitativ stigning i detektiv kvanteeffektiviteten (DQE) – et mål for, hvor meget støj en detektor tilføjer til et billede. Disse kameraer optager også film med hundredvis af billeder i sekundet, hvilket muliggør hurtig ^{dataindsamling9,10}. Alle disse egenskaber gør hurtige direkte detektionskameraer velegnede til lavdosisapplikationer.

Bevægelseskorrigerede stakbilleder bruges til databehandling til at beregne 2D-klassificering og rekonstruere et 3D-tæthedskort over makromolekyler ved hjælp af forskellige softwarepakker som ^RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 og EMAN215. Men for enkelt-partikel analyse, et enormt datasæt er nødvendig for at opnå en høj opløsning struktur. Derfor er automatiske dataindsamlingsafgifter meget afgørende for dataindsamlingen. For at registrere store cryo-EM-datasæt er flere softwarepakker blevet brugt i løbet af det seneste årti. Dedikerede softwarepakker, såsom ^AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, ^SerialEM19, UCSF-Image420, _TOM221, ^SAM22, ^JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS og EPU, er udviklet til automatiseret dataindsamling.

Disse softwarepakker bruger rutinemæssige opgaver til at finde hulpositioner automatisk ved at korrelere de lave forstørrelsesbilleder til billeder med høj forstørrelse, hvilket hjælper med at identificere huller med glasagtig is af passende istykkelse til billedopsamling under lavdosisforhold. Disse softwarepakker har reduceret antallet af gentagne opgaver og øget gennemløbet af cryo-EM dataindsamling ved at erhverve en stor mængde af god kvalitet data i flere dage kontinuerligt, uden afbrydelse og den fysiske tilstedeværelse af operatøren. Latitude-S er en lignende softwarepakke, som bruges til automatisk dataindsamling til enkeltpartikelanalyse. Denne softwarepakke er dog kun egnet til K2/K3 DED’er og leveres med disse detektorer.

Denne protokol demonstrerer Latitude-S’s potentiale i den automatiserede billedopsamling af SARS-CoV-2 spikeprotein med en direkte elektrondetektor udstyret med en 200 keV cryo-EM (se materialetabellen). Ved hjælp af dette dataindsamlingsværktøj erhverves der automatisk 3.000 filmfiler med SARS-CoV-2 spikeprotein, og yderligere databehandling udføres for at opnå en 3.9-4.4 Å-opløsning spikeproteinstruktur.