Enkelt-partikel cryo-elektronmikroskopi kræver en passende softwarepakke og brugervenlig rørledning til automatisk dataindsamling med høj kapacitet. Her præsenterer vi anvendelsen af en fuldautomatisk softwarepakke til billedopkøb, Latitude-S, og en praktisk pipeline til dataindsamling af vitrified biomolekyler under lavdosisforhold.
I de sidste mange år har teknologiske og metodiske fremskridt inden for enkeltpartikel kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) banet en ny vej for høj opløsning struktur bestemmelse af biologiske makromolekyler. På trods af de bemærkelsesværdige fremskridt inden for kryo-EM er der stadig plads til forbedringer i forskellige aspekter af enkeltpartikelanalysearbejdsgangen. Enkeltpartikelanalyse kræver en passende softwarepakke til automatisk dataindsamling med høj kapacitet. Flere automatiske dataindsamling softwarepakker blev udviklet til automatisk billedbehandling for single-partikel cryo-EM i de sidste otte år. Dette papir præsenterer en anvendelse af en fuldautomatisk billedopsamlingspipeline til vitrified biomolekyler under lavdosisforhold.
Det viser en softwarepakke, som kan indsamle cryo-EM-data fuldt, automatisk og præcist. Derudover styres forskellige mikroskopiske parametre let af denne softwarepakke. Denne protokol demonstrerer potentialet i denne softwarepakke i automatiseret billeddannelse af det alvorlige akutte luftvejssyndrom-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spikeprotein med et 200 keV kryo-elektronmikroskop udstyret med en direkte elektrondetektor (DED). Omkring 3.000 cryo-EM film billeder blev erhvervet i en enkelt session (48 timer) af dataindsamling, hvilket giver en atomare opløsning struktur af spike protein sars-CoV-2. Desuden indikerer denne strukturelle undersøgelse, at spikeproteinet vedtager to større konformationer, 1-RBD (receptorbindende domæne) åben og alle RBD ned lukkede konformationer.
Single-partikel cryo-EM er blevet en mainstream strukturel biologi teknik til høj opløsning struktur bestemmelse af biologiske makromolekyler1. Enkeltpartikelrekonstruktion afhænger af erhvervelse af et stort antal mikrografer af vitrified prøver til at udtrække todimensionelle (2D) partikelbilleder, som derefter bruges til at rekonstruere en tredimensionel (3D) struktur af en biologisk makromolekyle2,3. Før udviklingen af DED’er varierede opløsningen opnået fra enkeltpartikelrekonstruktion mellem 4 og 30 Å4,5. For nylig har den opnåelige opløsning fra enkelt-partikel cryo-EM nået ud over 1,8 Å6. DED og automatiseret dataindsamling software har været store bidragydere til denne opløsning revolution7, hvor menneskelig intervention for dataindsamling er minimal. Generelt udføres cryo-EM-billeddannelse ved lave elektrondosishastigheder (20-100 e/Å2) for at minimere elektronstråleinduceret strålingsskader af biologiske prøver, hvilket bidrager til det lave signal-til-støj-forhold (SNR) i billedet. Denne lave SNR hindrer karakteriseringen af de høje opløsningsstrukturer af biologiske makromolekyler ved hjælp af enkeltpartikelanalyse.
Den nye generation elektrondetektorer er CMOS (komplementære metal-oxid-halvleder)-baserede detektorer, som kan overvinde disse lave SNR-relaterede forhindringer. Disse CMOS-kameraer til direkte detektion giver mulighed for hurtig udlæsning af signalet, som kameraet bidrager med bedre punktspredningsfunktion, passende SNR og fremragende detektivkvanteeffektivitet (DQE) til biologiske makromolekyler. Direkte detektionskameraer tilbyder høj SNR8 og lav støj i de optagede billeder, hvilket resulterer i en kvantitativ stigning i detektiv kvanteeffektiviteten (DQE) – et mål for, hvor meget støj en detektor tilføjer til et billede. Disse kameraer optager også film med hundredvis af billeder i sekundet, hvilket muliggør hurtig dataindsamling9,10. Alle disse egenskaber gør hurtige direkte detektionskameraer velegnede til lavdosisapplikationer.
Bevægelseskorrigerede stakbilleder bruges til databehandling til at beregne 2D-klassificering og rekonstruere et 3D-tæthedskort over makromolekyler ved hjælp af forskellige softwarepakker som RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 og EMAN215. Men for enkelt-partikel analyse, et enormt datasæt er nødvendig for at opnå en høj opløsning struktur. Derfor er automatiske dataindsamlingsafgifter meget afgørende for dataindsamlingen. For at registrere store cryo-EM-datasæt er flere softwarepakker blevet brugt i løbet af det seneste årti. Dedikerede softwarepakker, såsom AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS og EPU, er udviklet til automatiseret dataindsamling.
Disse softwarepakker bruger rutinemæssige opgaver til at finde hulpositioner automatisk ved at korrelere de lave forstørrelsesbilleder til billeder med høj forstørrelse, hvilket hjælper med at identificere huller med glasagtig is af passende istykkelse til billedopsamling under lavdosisforhold. Disse softwarepakker har reduceret antallet af gentagne opgaver og øget gennemløbet af cryo-EM dataindsamling ved at erhverve en stor mængde af god kvalitet data i flere dage kontinuerligt, uden afbrydelse og den fysiske tilstedeværelse af operatøren. Latitude-S er en lignende softwarepakke, som bruges til automatisk dataindsamling til enkeltpartikelanalyse. Denne softwarepakke er dog kun egnet til K2/K3 DED’er og leveres med disse detektorer.
Denne protokol demonstrerer Latitude-S’s potentiale i den automatiserede billedopsamling af SARS-CoV-2 spikeprotein med en direkte elektrondetektor udstyret med en 200 keV cryo-EM (se materialetabellen). Ved hjælp af dette dataindsamlingsværktøj erhverves der automatisk 3.000 filmfiler med SARS-CoV-2 spikeprotein, og yderligere databehandling udføres for at opnå en 3.9-4.4 Å-opløsning spikeproteinstruktur.
Latitude-S er en intuitiv brugergrænseflade, som giver et miljø til automatisk at konfigurere og indsamle tusindvis af mikrografer eller filmfiler i høj opløsning på to dage. Det giver nem navigation på tværs af gitrene og bevarer placeringen af mikroskopstadiet, mens det bevæger sig fra lav forstørrelse til høj forstørrelse. Hvert trin i dataindsamlingen med Latitude-S er tidseffektivt med funktioner som en enkel brugergrænseflade, hurtig streaming af data med op til 4,5 GB /s hastighed og samtidig visning a…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender Department of Biotechnology, Department of Science and Technology (DST) og Science, og Ministry of Human Resource Development (MHRD), Indien, for finansiering og cryo-EM facilitet på IISc-Bangalore. Vi anerkender DBT-BUILDER Program (BT/INF/22/SP22844/2017) og DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) for National Cryo-EM facilitet på IISc, Bangalore. Vi anerkender finansiel støtte fra Science and Engineering Research Board (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 og SERB-IPA/2020/000094), DBT (bevilling nr. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Vi takker Ms Ishika Pramanick for at forberede cryo-EM gitre, cryo-EM dataindsamling, og forberede tabellen over materialer. Vi takker også Mr. Suman Mishra for cryo-EM billedbehandling og for at hjælpe os med at forberede tallene. Vi takker Prof. Raghavan Varadarajan for at hjælpe os med at få den rensede spike proteinprøve til denne undersøgelse.
Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |