Logiciel d’acquisition de données convivial, à haut débit et entièrement automatisé pour la cryo-microscopie électronique à particule unique

La cryo-EM monoparticule est devenue une technique de biologie structurale courante pour la détermination de la structure à haute résolution des macromolécules ^biologiques1. La reconstruction d’une seule particule dépend de l’acquisition d’un grand nombre de micrographies d’échantillons vitrifiés pour extraire des images de particules bidimensionnelles (2D), qui sont ensuite utilisées pour reconstruire une structure tridimensionnelle (3D) d’une macromolécule ^{biologique2,3}. Avant le développement des DED, la résolution obtenue à partir de la reconstruction d’une seule particule variait entre 4 et 30 ^Å4,5. Récemment, la résolution réalisable de la cryo-EM à particule unique a dépassé 1,8 ^Å6. Le DED et les logiciels automatisés d’acquisition de données ont largement contribué à cette révolution de ^résolution7, où l’intervention humaine pour la collecte de données est minime. En règle générale, l’imagerie cryo-EM est réalisée à de faibles débits de dose d’électrons (20-100 e/^Å2) pour minimiser les dommages causés par le rayonnement induit par le faisceau d’électrons des échantillons biologiques, ce qui contribue au faible rapport signal/bruit (SNR) de l’image. Ce faible SNR empêche la caractérisation des structures à haute résolution des macromolécules biologiques à l’aide d’une analyse monoparticulaire.

Les détecteurs d’électrons de nouvelle génération sont des détecteurs à base de CMOS (complementary metal-oxide-semiconductor), qui peuvent surmonter ces obstacles à faible SNR. Ces caméras CMOS à détection directe permettent une lecture rapide du signal, grâce à laquelle la caméra contribue à une meilleure fonction d’étalement de points, à un SNR approprié et à une excellente efficacité quantique de détection (DQE) pour les macromolécules biologiques. Les caméras à détection directe offrent un ^SNR8 élevé et un faible bruit dans les images enregistrées, ce qui entraîne une augmentation quantitative de l’efficacité quantique du détective (DQE), une mesure de la quantité de bruit qu’un détecteur ajoute à une image. Ces caméras enregistrent également des films à la vitesse de centaines d’images par seconde, ce qui permet une acquisition rapide ^{des données9,10}. Toutes ces caractéristiques rendent les caméras à détection directe rapide adaptées aux applications à faible dose.

Les images de pile corrigées du mouvement sont utilisées pour le traitement des données afin de calculer la classification 2D et de reconstruire une carte de densité 3D de macromolécules à l’aide de divers logiciels tels que ^RELION11, ^FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 et ^EMAN215. Cependant, pour l’analyse d’une seule particule, un énorme ensemble de données est nécessaire pour obtenir une structure à haute résolution. Par conséquent, les péages d’acquisition automatique de données sont très essentiels pour la collecte de données. Pour enregistrer de grands ensembles de données cryo-EM, plusieurs progiciels ont été utilisés au cours de la dernière décennie. Des progiciels dédiés, tels que ^AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, ^SerialEM19, UCSF-Image420, _TOM221, ^SAM22, ^JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS et EPU, ont été développés pour l’acquisition automatisée de données.

Ces progiciels utilisent des tâches de routine pour trouver automatiquement les positions des trous en corrélant les images à faible grossissement aux images à fort grossissement, ce qui aide à identifier les trous avec de la glace vitreuse d’épaisseur de glace appropriée pour l’acquisition d’images dans des conditions à faible dose. Ces progiciels ont permis de réduire le nombre de tâches répétitives et d’augmenter le débit de la collecte de données cryo-EM en acquérant une grande quantité de données de bonne qualité pendant plusieurs jours en continu, sans aucune interruption et sans la présence physique de l’opérateur. Latitude-S est un progiciel similaire, utilisé pour l’acquisition automatique de données pour l’analyse d’une seule particule. Cependant, ce progiciel ne convient qu’aux DED K2/K3 et est fourni avec ces détecteurs.

Ce protocole démontre le potentiel de Latitude-S dans l’acquisition automatisée d’images de la protéine de pointe SARS-CoV-2 avec un détecteur d’électrons direct équipé d’un cryo-EM de 200 keV (voir le Tableau des matériaux). À l’aide de cet outil de collecte de données, 3 000 fichiers vidéo de la protéine de pointe du SARS-CoV-2 sont automatiquement acquis et un traitement ultérieur des données est effectué pour obtenir une structure protéique de pointe de résolution 3,9-4,4 Å.