Brukervennlig, høy gjennomstrømning og helautomatisk datainnsamlingsprogramvare for kryo-elektronmikroskopi med én partikkel

Single-particle cryo-EM har blitt en vanlig strukturell biologi teknikk for høyoppløselig struktur bestemmelse av biologiske ^{makromolekyler1}. Enkeltpartikkelrekonstruksjon avhenger av å skaffe seg et stort antall mikrografer av vitrifiserte prøver for å trekke ut todimensjonale (2D) partikkelbilder, som deretter brukes til å rekonstruere en tredimensjonal (3D) struktur av en biologisk ^{makromolekyl2,3}. Før utviklingen av DEDs varierte oppløsningen fra enkeltpartikkelrekonstruksjon mellom 4 og 30 ^Å4,5. Nylig har den oppnåelige oppløsningen fra single-particle cryo-EM nådd utover 1,8 ^Å6. DED og automatisert datainnsamlingsprogramvare har vært viktige bidragsytere til denne oppløsningsrevolusjonen7, der menneskelig intervensjon for datainnsamling er minimal. Generelt utføres kryo-EM-avbildning ved lave elektrondosehastigheter (20-100 e/^Å2) for å minimere elektronstråleindusert strålingsskade av biologiske prøver, noe som bidrar til det lave signal-til-støy-forholdet (SNR) i bildet. Denne lave SNR hindrer karakteriseringen av høyoppløselige strukturer av biologiske makromolekyler ved hjelp av enkeltpartikkelanalyse.

Den nye generasjonen elektrondetektorer er CMOS (komplementære metalloksid-halvleder)-baserte detektorer, som kan overvinne disse lave SNR-relaterte hindringene. Disse direkte deteksjon CMOS-kameraene tillater rask avlesning av signalet, på grunn av hvilket kameraet bidrar til bedre punktspredningsfunksjon, egnet SNR og utmerket detektiv kvanteeffektivitet (DQE) for biologiske makromolekyler. Direkte deteksjonskameraer tilbyr høy ^SNR8 og lav støy i de innspilte bildene, noe som resulterer i en kvantitativ økning i detektiv kvanteeffektivitet (DQE) – et mål på hvor mye støy en detektor legger til et bilde. Disse kameraene tar også opp filmer med hastigheten på hundrevis av bilder per sekund, noe som muliggjør rask ^{datainnsamling9,10}. Alle disse egenskapene gjør raske direkte deteksjonskameraer egnet for lavdoseapplikasjoner.

Bevegelseskorrigerte stakkbilder brukes til databehandling for å beregne 2D-klassifisering og rekonstruere et 3D-tetthetskart over makromolekyler ved hjelp av ulike programvarepakker som ^RELION11, ^FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 og EMAN215. For enkeltpartikkelanalyse er det imidlertid nødvendig med et enormt datasett for å oppnå en høyoppløselig struktur. Derfor er automatisk datainnsamlingsavgift svært viktig for datainnsamling. For å registrere store cryo-EM-datasett har flere programvarepakker blitt brukt det siste tiåret. Dedikerte programvarepakker, for eksempel ^AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, ^SerialEM19, UCSF-Image420, _TOM221, ^SAM22, ^JAMES23, ^JADAS24, EM-TOOLS og EPU, er utviklet for automatisert datainnsamling.

Disse programvarepakkene bruker rutinemessige oppgaver for å finne hullposisjoner automatisk ved å korrelere bildene med lav forstørrelse til bilder med høy forstørrelse, som hjelper til med å identifisere hull med glassaktig is av appropriativ istykkelse for bildeanskaffelse under lavdoseforhold. Disse programvarepakkene har redusert antall repeterende oppgaver og økt gjennomstrømningen av cryo-EM-datainnsamlingen ved å skaffe seg en enorm mengde data av god kvalitet i flere dager kontinuerlig, uten avbrudd og den fysiske tilstedeværelsen til operatøren. Latitude-S er en lignende programvarepakke, som brukes til automatisk datainnsamling for enkeltpartikkelanalyse. Denne programvarepakken er imidlertid bare egnet for K2/ K3 DEDs og er utstyrt med disse detektorene.

Denne protokollen demonstrerer potensialet til Latitude-S i den automatiserte bildeinnhentingen av SARS-CoV-2 spikeprotein med en direkte elektrondetektor utstyrt med en 200 keV cryo-EM (se materialtabellen). Ved hjelp av dette datainnsamlingsverktøyet blir 3000 filmfiler av SARS-CoV-2 spike protein automatisk anskaffet, og ytterligere databehandling utføres for å oppnå en 3,9-4,4 Å oppløsning spike proteinstruktur.