성인 마우스 입천장에서 1 차 구강 각막 세포의 격리 및 문화

모든 동물 실험은 구마모토 대학과 츠쿠바 대학의 기관 동물 실험 위원회 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 시약 및 문화 매체 의 준비 칼슘 60 μM 및 항생제 항mycotic 용액600 μL을 포함하는 각질 세포 배양 배지 40mL를 준비하십시오. 항생제 항mycotic 용액의 0.025 % 트립신과 400 μL의 20 mL을 준비합니다. 트립신 억제 용액을 실온에서 해동하고 4.1 단계에서 사용할 때까지 4 °C에서 유지하십시오.참고: 격리 시약은 5마리의 마우스의 조직 격리를 위해 준비됩니다. 문화 매체를 준비하려면 500mL의 배지를 가지고 5mL의 성장 보충제 용액(이하 재료표 참조)과 20% 칼슘 고갈된 첼렉스-태아 소 혈청(FBS)33 (이하 첼렉스-FBS라고 함)을 추가한다. 2. 성인 마우스에서 미각 조직의 해부 동물 복지와 관련된 시설의 규정에 따라 자궁 경부 탈구로 성인 C57BL/6J 마우스(남성 또는 여성)를 희생하십시오. 면도기로 입 주위의 머리카락을 제거합니다. 가위를 사용하여 뺨에서 턱쪽으로 양쪽으로 자른다.참고: 마우스는 희생하기 전에 마취해야 합니다. 메데토미딘, 미다졸람 및 부안소올의 마취 혼합물이 사용됩니다( 재료표 참조). 집게를 사용하여 입을 넓게 열고 면봉을 사용하여 혈액을 흡수하십시오. 입맛을 소독하려면 10% 포비도요오드가 들어있는 면봉으로 입 안을 닦아냅니다. 마우스 입맛을 수확하려면 먼저 외과용 메스 블레이드를 사용하여 상악 치아의 입맛을 따라 전체 두께 한계 절개를 합니다. 그런 다음, 조심스럽게 raspatorium을 사용하여 전체 미각을 해부.참고: raspatorium은 무코피리오스토프 플랩을 높이는 데 사용되는 도구입니다( 재료 표 참조) (그림 1B 참조). 완전한 배지 + 항생제 항mycotic 용액의 4 mL을 포함하는 15 mL 튜브로 입맛 조직을 신속하게 전달합니다. 잠복이 준비될 때까지 조직을 얼음 위에 두십시오.참고: 여러 마우스의 수집을 위해, 구개 조직은 최대 4시간 동안 얼음 위에 보관될 수 있다. 3. 입맛 조직의 전처리 라미나르 플로우 후드에서 조직을 완전한 배지 + 항생제 항mycotic 용액 4mL를 포함하는 60mm 접시로 이송합니다. 짧고 무딘 집게와 메스 블레이드를 사용하여 조직에서 혈액을 부드럽게 제거합니다. 전체 매체로 조직을 10번 씻으시면 됩니다. 조직을 0.025% 트립신 + 항생제 항진성 용액의 4mL를 함유한 35mm 접시로 옮기고 상피 표면이 아래로 향합니다.참고: 안쪽으로 구부러진 상피 표면은 트립신 용액에 담가야 합니다. 라미나 프로프리아는 얼굴을 맞대고 있어야 합니다. 조직은 트립신 용액에서 완전히 배양될 수 있도록 가능한 한 평평하게해야합니다. 배양 후드의 실온에서 ~16h의 트립신은 0.025%로 조직을 배양한다. 4. 1차 세포의 수집 및 배양 무딘 집게 한 켤레를 사용하여 트립신 용액 (35mm 접시)에서 조직을 제거하고 상피 표면이 위로 향하는 60mm 접시 (접시 당 4 mL)로 트립신 억제제 용액으로 옮습니다. 포셉을 사용하여 입맛의 가장자리를 잡고 메스 블레이드를 사용하여 근본적인 라미나 프로프리아에서 상피 층을 부드럽게 긁어냅니다.참고 : 결합 조직은 트립신에 의해 소화되지 않으므로 긁는 동안 벗겨지지 않습니다. 조직에서 상피 세포의 최대 량을 수집하려면 조직을 4mL 의 완전한 배지로 다른 60mm 접시로 옮기고 스크래핑 단계를 반복합니다.참고 : 블레이드의 끝으로 조직을 긁어 하지 않도록해야합니다; 대신 블레이드의 가장자리를 사용합니다. 스크래핑은 조직 당 5-10 분 동안 수행됩니다. 멸균 100 μm 세포 스트레이너를 50mL 원문 튜브 위에 놓습니다. 멸균 파이펫을 사용하여 트립신 용액 2mL(4.1단계에서)를 스트레이너로 옮겨 표면을 적시십시오. 파이펫을 사용하여 60mm 접시(4.2-4.3단계)에서 셀 서스펜션을 몇 번 혼합하고 4.4-4.5 단계로 준비된 100μm 셀 스트레이너를 통해 세포를 필터링합니다. 혈종계를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 트라이판 블루 용액 15μL을 준비하고 셀 서스펜션 15μL(단계 4.6)를 추가합니다. 세포-트라이판 블루 믹스의 10 μL을 혈류계로 옮기고 세포 수를 계산합니다.참고: 마우스 입맛 한 조각은 최대 100만 개의 셀을 생성할 수 있습니다. 계산하는 동안, 원심 분리튜브 (단계 4.6에서) 실온에서 5 분 동안 100 x g 에서. 피펫으로 슈퍼네티를 흡인합니다. 튜브에 완전한 매체 + chelexed-FBS 2mL을 추가합니다. 5mL 파이펫을 사용하여 여러 번 트리튜레이션하여 셀 펠릿을 다시 중단합니다. 1 마우스에서 2-5 x 105 셀을 콜라겐 타입 I로 미리 코팅한 24웰 플레이트의 한 우물로 플레이트 2-5 x 105 셀( 재료 표 참조). 배지를 변경하지 않고 2 일 동안 37 °C에서 세포를 배양합니다. 시드 후 2일 후, 배양 매체의 절반을 완전한 매체 + chelexed-FBS로 교체하십시오. 현미경의 밑에 세포 형태학을 확인하십시오. 2일마다 완전한 배지 + chelexed-FBS로 셀을 공급합니다.참고: 시드에 따라 크기가 다른 셀이 관찰됩니다. 파종 후 약 3-5일 후, 조약돌 형태가 있는 각질 세포(도 2)를 관찰할 수 있다. 첫 번째 통로를 실시하기 전에 1-2 주가 걸리며 세포가 두 번째 및 세 번째 구절을 준비하기 전에 1-2 주가 필요합니다. 그 후, 세포는 더 빨리 성장하고 냉동 보존을 위해 준비 될 수있다. 세포는 각각 1회 및 제2 통로에서 하나의 우물(24웰 플레이트)과 6웰 플레이트로 재도금될 수 있다. 후속 통로는 세포 성장 및 밀도에 의존할 것입니다. 세포 분할 비율은 1:2 또는 1:3의 세포 분할 비율을 제 3 통로 후에 사용할 수 있다. 5. 각막세포 통로 문화 접시에서 상체 2mL를 수집하고 15 mL 원색 튜브 (얼음)로 분배하십시오. 멸균 1x PBS로 셀을 두 번 씻으시면 됩니다.참고: 세포가 약 70%-80%의 합류에 도달하면 통과할 준비가 되어 있습니다. 접시에 0.05% 트립신-EDTA의 1mL을 6웰 플레이트의 우물에 넣습니다. 37 °C에서 5-15 분 동안 배양; 5 분 후에 세포가 접시에서 분리되는지 확인하십시오. 트립신 억제 용액 1mL및 완전한 배양 배지 + chelexed-FBS의 2mL을 사용하여 반응을 부드럽게 배관하여 중화한다. 다음으로, 5.1단계와 동일한 15mL 원문 튜브로 세포 현탁액을 전달한다. 4°C에서 5분 동안 100 x g 의 세포 현탁액을 원심분리합니다. 피펫으로 상류체를 흡인하고 완전한 배양 배지의 1 mL에서 셀 펠릿을 재놓습니다. 혈전계를 사용하여 세포를 계산합니다. 다음으로, 새로운 24- 또는 6-웰 배양 판으로 셀 서스펜션의 플레이트 1 mL.참고: 초기 통로에서 세포의 일부는 70% 완전 배양 배지 + 20% chelexed-FBS + 10% DMSO의 혼합물로 냉동될 수 있다. 세포의 1-2 극저온은 하나의 컨실리 배양 플레이트로부터 수집될 수 있다. 6. 각질 세포의 냉동 보존 및 복구 셀 동결 각질 세포를 80%-90%로 증가시면 됩니다.참고: 세포가 과도하게 증가하는 것을 허용하지 마십시오. 5.1-5.5 단계에 설명된 대로 요리의 각질 세포가 0.05% 트립신-EDTA로 처리합니다. 혈종계를 사용하여 각질 세포를 계산합니다. 각 유리병에 1 x 106 세포/mL의 전송을 허용하기 위하여 계산된 세포 수에 근거를 둔 극저온을 준비합니다. 4°C에서 5분 동안 100 x g 의 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상체를 버리고 10 % DMSO + 20 % 첼렉스 -FBS + 70 % 완전한 배양 배지 (9 mL + chelexed-FBS 및 DMSO 1 mL)의 10 mL 용액에서 셀 펠릿을 다시 분리하십시오. 유리병 당 서스펜션의 1 mL에서 극저온으로 세포를 분배. 바이알을 밤새 극저온 저장 용기에 -80°C로 놓습니다. 다음 날 유리병을 액체 질소 탱크로 옮기. 세포 복구 액체 질소 탱크에서 극저온을 제거하고 실온에서 부분적으로 해동하십시오. 15mL 튜브에서 셀 서스펜션의 1mL을 완전한 배양 배지 + chelexed-FBS의 3mL와 혼합한다. 100 x g 및 4 °C에서 5 분 동안 혼합물을 원심 분리합니다. 상체를 버리고 완전한 배양 배지 + chelexed-FBS의 1 mL에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 셀 서스펜션을 새로운 60mm 콜라겐 I 코팅 배양 접시에 접시를 접시에 넣습니다. 배양 배지를 2-3일마다 교체하고 한 번 수렴한 세포를 통과한다. 7. 면역형광 염색 정사각형 커버의 배양 구강 각질은 2 일 동안 6 웰 플레이트 (5 x 105 세포 / 웰)의 입술 (22mm x 22mm)입니다. 각질 세포는 4% 파라포름알데히드(PFA)와 PBS를 실온에서 20분 동안 수정한 후 PBS1x로 세 번 세척합니다. PBS에서 0.1% 트리톤의 용액에서 세포를 페메아빌화합니다. 실온에서 1시간 동안 시약(염소 세럼 2.5%, 당나귀 세럼 2.5%) 차단세포를 배양한 다음, 4°C에서 1차 항체를 가진 야간 배양( 재료표 참조)을 갖는다.참고: 1차 항체는 토끼 항K14(1:1000), 랫트 α6-integrin(1:100), 토끼 안티-p63(1:500), 토끼 안티-K13(1:100), 염소 안티 PDGFRα(1:100)에서 사용되었다. PBS에서 0.1% 트리톤의 용액으로 샘플을 세척하고 실온에서 1 시간 동안 이차 항체로 배양합니다.참고: 이차 항체(Alexa 488 또는 555)는 1:300 희석에서 사용되었다. 10 분 동안 Hoechst 용액을 가진 모든 샘플을 카운터 스테인하고 유리 슬라이드에 셀을 장착합니다.참고 : Hoechst 용액은 세포의 핵을 얼룩시키는 데 사용됩니다. 공초점 현미경을 사용하여 샘플 이미징을 수행합니다.참고: 밝기와 콘트라스트는 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 동일한 강도로 조정됩니다.