JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biología del desarrollo

דור של מסלקי בלסטודרם נאיביים מעוברי דגי זברה

Published: July 30, 2021
doi:
10.3791/62797
,
1Center for Precision Environmental Health and Department of Molecular and Cellular Biology,Baylor College of Medicine

Summary

explants blastoderm דגי זברה נוצרים על ידי בידוד תאים עובריים ממרכזי איתות אנדוגני בתוך העובר המוקדם, ומייצרים אשכולות תאים נאיביים יחסית מניפולציה בקלות ו ex vivoתרבית . מאמר זה מספק הוראות להכנת explants כאלה ומדגים את התועלת שלהם על ידי חקירת תפקידים עבור נודל איתות במהלך gastrulation.

Abstract

בשל בהירותם האופטית והתפתחותם המהירה, עוברים של דגי זברה הם מערכת מצוינת לבחינת התנהגויות תאים ותהליכים התפתחותיים. עם זאת, בגלל המורכבות והיתירות של אותות עובריים, זה יכול להיות מאתגר להבחין בתפקיד המלא של כל אות יחיד במהלך העובר המוקדם. על ידי הסבר אזור החיות של blastoderm דג זברה, אשכולות נאיביים יחסית של תאים עובריים נוצרים שניתן לתרבות בקלות ומניפולציה ex vivo. על ידי החדרת גן של עניין על ידי הזרקת RNA לפני explantation, ניתן להעריך את ההשפעה של מולקולה זו על ביטוי גנים, התנהגויות תאים, ותהליכים התפתחותיים אחרים בבידוד יחסי. יתר על כן, תאים מעוברים של גנוטיפים שונים או תנאים ניתן לשלב explant כימרי יחיד כדי לבחון אינטראקציות תא / רקמה פונקציות גנים ספציפיים לרקמות. מאמר זה מספק הוראות ליצירת explants blastoderm דגי זברה ומדגים כי מולקולת איתות אחת – ליגנד Nodal – מספיק כדי לגרום היווצרות שכבת חיידקים מורפוגנזה הרחבה ברקמות עובריות נאיביות אחרת. בשל יכולתם לשחזר התנהגויות תאים עובריים, שיפועי מורפוגן ודפוסי ביטוי גנים במערכת ex vivo פשוטה, explants אלה צפויים להיות לעזר רב לחוקרי דגי זברה רבים.

Introduction

מטרה רב-שנתית של תחום הביולוגיה ההתפתחותית היא לפענח את המורכבות של התפתחות העוברים כדי להבין את מקור הצורה והתפקוד של בעלי החיים. אפילו עוברים מוקדמים מכילים תערובת מורכבת של מולקולות איתות, אינטראקציות בין תאים לרקמות וכוחות מכניים, כולם כפופים לוויסות מרחבי וטמפורלי קפדני. מסיבה זו, לעתים קרובות מאתגר להצביע על התפקיד המדויק של אות מסוים בתהליך התפתחותי של עניין. על ידי הסרת רקמות עובריות מהסביבה האנדוגנית שלהם, explantation העובר יוצר פלטפורמה פשוטה שבה להבחין בתפקידים ההתפתחותיים של רקמות בודדות ומולקולות בבידוד יחסי. טכניקות Explantation ידועות אולי ביותר ב Xenopus laevis, שם הם שימשו לחקר אינדוקציה רקמות, איתות תאים, הידבקות תאים, ומורפוגנזה, בין תהליכים אחרים1,2,3,4. מה שנקרא explants כובע בעלי חיים, שבו אזור החיה של באסטולה שלב קסנופוס עוברים מבודד לפני אינטראקציות אינדוקטיביות5,6,7, הם טכניקה הסברה נפוצה וחזקה. כובעי בעלי חיים לא מנוהלים נגזרים להיות ectoderm7,8. ובכל זאת, הם מוכשרים להגיב למספר גורמים אינדוקטיביים, המאפשרים להם ליצור רקמות של כל שלוש שכבות הנבט ולעבור תנועות מורפוגנטיות מתאימות לרקמות9,10,11. עם זאת, כלים גנטיים מוגבלים והתאמת תת-אופטימלית להדמיה חיה מונעים שימוש באקספלנטים של כובע בעלי חיים של קסנופוס עבור ביולוגים התפתחותיים רבים. על ידי הסבר תאי blastoderm מעוברי דגי זברה, החוקרים יכולים לשלב את התועלת של בדיקת כובע בעלי חיים עם הבהירות האופטית, שפע הכלים הגנטיים ויתרונות ניסיוניים אחרים של מערכת מודל דגי הזברה.

עד כה, החוקרים עשו שימוש בשני טעמים של explants דג זברה: מה שנקרא pescoids ואת explants blastoderm. במודל פסקואיד, כל blastoderm, כולל האזור השולי, מבודד מן החלמון ומותר לפתח ex vivo ללא שכבת סנכרון חלמון חוץ-בקטריוני (YSL)12,13. בדרך זו, פסקואידים נושאים דמיון בולט ל explants Fundulus שנוצר לפני עשרות שנים על ידי ג’יין אופנהיימר וג’יי.פי טרינקאוס14,15. אלה explulatants לשחזר היבטים רבים של דפוס עוברי מורפוגנזה12,13. עם זאת, מכיוון שמבודדים אלה מכילים מרכזי איתות אנדוגניים (השוליים העובריים), הם אינם פשוטים ביחס למילייה המולקולרי שלהם. לחלופין, חוקרים יכולים ליצור explants blastoderm דגי זברה נאיביים יחסית על ידי אי הכללת האזור השולי16,17,18,19,20,21. מחוללי פיצוץ דגי זברה לא מנוהלים מבטאים רמות גבוהות של מורפוגנים של חלבון מורפוגנטי בעצמות (BMP)19 ומעוררים ectoderm לא עצבי ושכבה עוטפת (EVL) כאשר18 אקס ויובתרבית . עם זאת, הם recapitulatulates היבטים רבים של דפוס צירי ומורפוגנזה בתגובה שיפועי איתות אקסוגני19,20,21, בדומה כובעי בעלי חיים קסנופוס. מסיבה זו, explants blastoderm הם מודל יתרון ללמוד את התפקיד של מורפוגן נתון (או מורפוגנים) במפרט שכבת נבט, תנועות תאים מורפוגנטיים, ושיפועי איתות בתוך סביבת איתות פשוטה. יתר על כן, blastoderms מעוברים של גנוטיפים שונים או תנאים ניתן לשלב explant כימרי יחיד19,21 כדי לחקור אוטונומיה של תאים / רקמה ואינטראקציות אינדוקטיביות.

ניתן להשתמש ב explants blastoderm דג זברה כדי לחקור את התפקיד של אותות עובריים (למשל, Nodal) במורפוגנזה ומפרט רקמה במהלך גסכולציה. על ידי הזרקת ndr2 RNA סינתטי (קידוד ליגנד Nodal) בשלב תא יחיד, איתות Nodal מופעל לאורך כל blastoderm של העובר. Explants מן העוברים האלה ליצור שיפועי איתות Nodal, ליצור את כל שלוש שכבות הנבט, ולעבור תנועות גסטרולציה התכנסות והרחבה (C&E) כפי שניתן לראות בעוברים שלמים20. בנוסף, explants כימרי משמשים כדי להמחיש את היכולת של רקמות mesoderm לגרום neuroectoderm מן blastoderm (נאיבי) uninjected. פרוטוקול זה מספק הוראות ליצירת explants blastoderm דג זברה ומדגים את התועלת שלהם בהגדרת התפקיד של איתות Nodal אינדוקציה רקמות ומורפוגנזה.

Protocol

1 הכינו את ריאגנטים ואספקה הכנה ריאגנט הכן 500 מ”ל של פתרון 3x דניאו (פתרון 1, טבלה 1). הכן 1 ליטר של מי ביצים (פתרון 2, טבלה 1). הכן פתרון 1.2% של אגרוז במי ביצה. ממיסים את האגורז לחלוטין במיקרוגל, ולאחר מכן מגניבים ל 55 מעלות צלזיוס באמבט מים. הכן מדיה explant 4 מ”ל (פתרון 3, טבלה 1, שונה מעט מ19,21) לכל מצב ניסיוני.הערה: זכור להסביר לפחות באר אחת של explants מעוברים לא מוזרקים (או בקרה מוזרק) בעת חישוב הנפח הנדרש. לחטא את סביבת העבודה עם 70% אתנול. הסר מדיה תרבית התא מ 4 °C ותרסיס /לנגב עם 70% אתנול. הפוך מדיה explant ומניחים אינקובטור 28 °C 28 °C להתחמם בזמן העוברים מוזרקים.הערה: כלול תמיד עוברים אחים תואמי גיל, שלמים למטרות היערכות. פירוק עוברים אלה ותרבות אותם על לוחות מצופים אגרוז בפתרון של Danieau 0.3x (פתרון 4, טבלה 1). הסר aliquots פרונז (1 מ”ל ב 20 מ”ג / מ”ל) מ -20 °C (70 °F) ולאפשר להפשיר על קרח. להפשיר אחד 1 mL aliquot לכל שלושה תנאים ניסיוניים. הכנת לוחות אגרוז הפוך את צלחות ההזרקה. מלאו צלחת פטרי מפלסטיק 100 מ”מ x 15 מ”מ באמצע הדרך עם אגורוז מותך במי ביצים. מניחים בעדינות את תבנית ההזרקה על גבי אגרוז מותך בזווית של 45 מעלות ומנמיכים אותה בהדרגה לתוך האגורוז, ומבטיחים כי אין בועות לכודות מתחת. תן לזה להתקרר לחלוטין. מוציאים את התבנית. השתמש בצלחת מיד או לשמור מאוחר יותר על ידי הוספת 2 מ”ל של מי ביצה, לעטוף את הצלחת, ולאחסן אותו ב 4 °C (70 °F). מחממים את הצלחת במשך 15-30 דקות באינקובטור 28.5 מעלות צלזיוס לפני ההזרקה. הפוך צלחות חיתוך explant. הוסיפו 3 מ”ל של אגרוז מותך 1.2% במי ביצה לצלחת פטרי 60 מ”מ x 15 מ”מ, מה שמבטיח שכל החלק התחתון של הבאר מצופה. תן לזה להתקרר לחלוטין. צלחות תרבות מעיל עם אגרוז. עבור כל מצב ניסיוני, לחלק 1 מ”ל של מותך 1.2% agarose במי ביצה לתוך באר אחת של צלחת 6-באר, להבטיח כי כל החלק התחתון של הבאר מצופה. תן לזה להתקרר לחלוטין. להכנת explants כימרי, ליצור צלחת חיתוך explant עם בארות קטנות על ידי הוספת שנים עשר חרוזי זכוכית 1 מ”מ אגארוז מותך בצלחת פטרי 60 מ”מ x 15 מ”מ. הסר את החרוזים עם מלקחיים ברגע אגרוז מתקרר לחלוטין. 2 להזריק עוברים עם RNA לובש כפפות, להסיר aliquot של ndr2 mRNA סינתטי מאחסון ב -80 °C (80 °F) ומיד למקם אותו על קרח. הכן את מחט ההזרקה. מלא מחט נימי זכוכית משוך עם RNA. מניחים את המחט המלאה לתוך מיקרו-מניפולטור ולשבור את קצה המחט עם מלקחיים. כייל נפח הזרקה באמצעות מיקרומטר שלב עם טיפה של שמן מינרלי, התאמת זמן הזרקה ולחץ על מזרק פנאומטי כדי להשיג בולוס של הגודל הרצוי. בולוס עם קוטר של 120 מיקרומטר יש נפח של 1 nL.הערה: הנפח הרצוי של בולוס יהיה תלוי בריכוז של RNA ואת המינון הרצוי לכל עובר. לדוגמה, אם RNA הוא aliquoted ב 10 ng / μL, להזריק 1 nL כדי להשיג כמות סופית של 10 pg. שמור את קצה מחט הרנ”א שקוע בשמן עד מוכן להזרקה. תעמיסו את העוברים ותזריקו. משכו את המחלצים במיכלי הרבייה, אפשרו לדגים להשריץ במשך 10-15 דקות, ואוספים את העוברים באמצעות מסננת תה. טען את העוברים לתוך צלחת ההזרקה באמצעות פיפטה פסטר ומשאבת פיפטה, ולאחר מכן להשתמש באצבע כפפות ללחוץ על הביצים לתוך שוקת בעדינות. הזריקו RNA 10 pg ndr2 לתוך החלמון של עוברים חד-תאיים עד שמספר העוברים הרצוי מגיע או עד שהעוברים מתחילים להתחלק.הערה: אין להזריק לאחר שלב תא בודד כדי להבטיח הפצה אחידה של ה- RNA בכל העובר. לשטוף את העוברים מתוך צלחת ההזרקה לתוך תווית 100 מ”מ x 15 מ”מ צלחת פטרי עם זרם עדין של מי ביצה מבקבוק לסחוט.הערה: שמור תמיד קבוצה של אחים תואמי גיל, שאינם מוזכרים כפקדים. מניחים את העוברים לתוך אינקובטור 28 °C (28°C) עד שהם מגיעים לשלב 128 תאים. מוציאים מהמנה ביצים לא מופרות ועוברים מתים. 3 Dechorionate העוברים לאחר שהעוברים הגיעו לשלב 128 התאים, הניחו אותם בצלחות פטרי מזכוכית מסומנות וקבעו מהם כמה שיותר מי ביצים. תוויות כלים מגבשות זכוכית עם סרט מעבדה (המתאים לשמות מנות קטנות) וממלאים 2/3 מהדרך במי ביצים. הניחו את הכלים האלה ליד המיקרוסקופ הניתח לנגישות מהירה. הוסף 1 מ”ל של ציר פרונאז (20 מ”ג / מ”ל, מופשר על קרח) ל 15 מ”ל של 3x הפתרון של Danieau בצינור חרוט 50 מ”ל.הערה: סכום זה מספיק עבור עד שלושה תנאים ניסיוניים. הגדל את נפח הפרונאז ואת הפתרון של 3x Danieau לתנאי הסבר נוספים.זהירות: פרונאז הוא מעצבן; לכן ללבוש כפפות בעת הטיפול. הוסיפו לפחות 5 מל של תמיסת פרונאז לכל צלחת פטרי המכילה עוברים. להסעיר את מנות הזכוכית בתנועה מעגלית, ניטור ההתקדמות של dechorionation בעקביות תחת מיקרוסקופ מנתח. ברגע שה chorions מתחילים להתקמט 1-2 עוברים הם מתוך chorions שלהם, בזהירות להטביע את צלחת פטרי המכיל פרונאז ואת העוברים לתוך צלחת התגבשות זכוכית המקבילה המכילה מי ביצים. לשטוף את העוברים dechorionated. לשטוף את העוברים שלוש פעמים עם מי ביצה על ידי הוספה בעדינות ולאחר מכן decanting מי ביצה מן המנה. השטיפה השלישית והאחרונה היא עם 0.3x הפתרון של דניאו.הערה: אם העוברים עדיין יש chorions לאחר הכביסה, בעדינות pipette העוברים עד chorions מוסרים או לתת להם לשבת בשטיפה (מי ביצה או 0.3x הפתרון של Danieau) במשך דקה או שתיים בעדינות להתסיס עם תנועות מעגליות. מכסים עוברים עם מכסה צלחת פטרי ומחזירים אותם לאינקובטור (28 מעלות צלזיוס) עד שהם מגיעים לשלב 256 התאים. 4 מגרשים חתוכים מלאו את צלחת הפטרי מצופה אגרוז 60 מ”מ x 15 מ”מ עם תמיסה של Danieau פי 3. לאחר העוברים נמצאים בשלב 256 תאים, להעביר אותם לתוך צלחת מצופה אגרוז המכיל פתרון 3x Danieau, בשורה אותם לאורך מרכז המנה. חותכים את המלקחיים באמצעות מלקחיים (איור 1). השתמש בזוג מלקחיים אחד, המוחזק סגור, כדי לייצב את העובר ולהשתמש באחר כדי לחתוך את הפיצוץ בכמחצית מגובהו (משוליים לקוטב בעלי חיים) (איור 1A). כדי לחתוך, לסחוט בעדינות את תאי blastoderm עם זוג אחד של מלקחיים. לאחר מכן, קחו את המלקחיים המייצבים והעבירו אותם לאורך המלקחיים האחרים כדי לפרוס בערך באמצע ה-blastoderm(איור 1B). סובבו את העובר, הניחו את המלקחיים לתוך החתך הקיים ולאחר מכן נתק את האורתוגונל הנותר של בלסטודרם לחתך הראשון(איור 1C). שמור explants בפתרון של 3x Danieau לפחות 5 דקות כדי לרפא, ולאחר מכן להעביר אותם לבאר של צלחת 6-באר מצופה agarose ומלא עם 4 מ”ל של מדיה explant.הערה: גזור הסברים מאחים שאינם מחוברים (או שליטה מוזרקת) כפקדים שליליים. אם explants מבוצעים כראוי, explants אלה לא להרחיב או להביע סמנים של אנדודרם, mesoderm, או neuroectoderm. מניחים את לוחות התרבות explant לתוך אינקובטור 28 °C 28 °C עד נקודת הזמן הרצוי / שלב (נקבע מאחים שלמים) הוא הגיע.הערה: אם מטפלים explants עם תרכובת, כגון מעכב מולקולה קטנה, הריכוז הרצוי ניתן להוסיף ישירות למדיה explant בתוך בארות בנקודות הזמן הרצויות. זכור לכלול את נפח האגרוז בעת חישוב ריכוזים. (דוגמה: 1 מ”ל agarose + 4 מ”ל explant מדיה = 5 מ”ל נפח כולל לכל טוב). 5 הכינו מסלקים כימריים במקום צלחת מצופה אגרוז רגילה, חותכים את הגימרים הכימריים בצלחת עם אגרוז יצוק ל-12 בארות קטנות ורדודות באמצעות חרוזי זכוכית 1 מ”מ (סעיף 1.2.4). מלא את הרמה הזאת עם פתרון 3x Danieau.הערה: explants כימרי נוצרים מתאי blastoderm של שני עוברים של גנוטיפים שונים או תנאים שונים. ודא כי תנאים אלה ניתן להבחין אחד מהשני על ידי ביטוי של סמנים פלואורסצנטיים מהונדסים או מוזרקים. היכונו על ידי הוספת 12 עוברים של גנוטיפ /מצב אחד לצד שמאל של הצלחת ושנים עשר עוברים של הגנוטיפ / התנאי האחר לצד ימין של הצלחת. מעבירים עובר אחד מכל תנאי למרכז הצלחת, ליד אחת מ-12 בארות. באמצעות מלקחיים, לחתוך explant מכל עובר כמתואר עבור explants עובר יחיד (שלב 4.3). לחץ במהירות על הקצוות החתוכים של שני explants יחד בתוך הבאר הרדודה באמצעות מלקחיים כדי לאפשר לשני החצאים לרפא יחד לתוך explant אחד. ממשיכים עם 11 בארות הנותרות בתוך הצלחת. לאחר explants נרפאים, להעביר אותם לבאר של צלחת 6-באר מצופה אגרוז ומלא 4 מ”ל של מדיה explant. חזור על הפעולה עד שהמספר הרצוי של explants מושגת. 6 תרבות ו/או תמונה של המהללים הקבועים תרבות explants באינקובטור 28 °C (28 °F) עד העוברים אחים שלמים להגיע לשלב הרצוי. ניתן להרכיב explants חיים להדמיה מתמדת בזמן, בתמונה מעת לעת לאורך כל תקופת התרבות, או תמונה חיה בנקודת הקצה הניסיונית. תקן את explants אם תרצה. ברגע explants להגיע לנקודת הקצה הרצויה, לציין את השלב של אחים עוברים שלמים ולהניח את explants לתוך בקבוקון נוצץ זכוכית עם 1 מ”ל של 4% paraformaldehyde ב PBS. תקן לילה על שייקר ב 4 °C (5 °F).זהירות: Paraformaldehyde הוא רעיל. ללבוש כפפות בעת טיפול כימי זה ולהיפטר ממנו באמצעות שיטות שאושרו על ידי כל מוסד. לאחר הקיבעון, יש לשטוף אביזרים שש פעמים, 15 דקות כל אחד עם PBS + 0.1% Tween-20, ולהתייבש בהדרגה לתוך מתנול. יש לאחסן explants ב -20 °C (70 °F) לניתוח מאוחר יותר על ידי ההר שלם בהכלאה במקום, כתמים אימונופלואורסצנטיים וכו ‘.

Representative Results

ליגנדים נודאל מניעים היווצרות שכבת נבט ו- C&E של explants blastoderm דגי זברהמסלקי בקרה שנחתכו מעוברים מסוג בר (WT) שאינם מושרשים או מאלה שהוזרקו עם 50 pg של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של mRNA נותרו מעוגלים לאורך כל תקופת התרבות(איור 2A-C)ולא הצליחו לבטא סמנים של מסודרם, אנדודרם או נוירוקטודרם ( איור3C)20. יחד, אלה מצביעים על היעדר מורפוגנזה היווצרות שכבת נבט המאפיינים גסטולציה חולייתית. עם זאת, explants לחתוך מן העוברים מוזרק עם 10 pg של ndr2 mRNA הפך מוארך מאוד לאחר 8-9 שעות בתרבות(איור 2D). הדמיה חיה בזמן-מעידה של explants אלה על ידי ניגודיות דיפרנציאלית (DIC) מיקרוסקופיה גילתה כי התחלה הרחבה ב 8 שעות או סביב 8 h לאחר ההפריה (hpf) (איור 2F),באותו הזמן כי C&E morphogenesis מתחיל בעוברים דג זברה שלם22. Explants לחתוך MZoep-/- עוברים, אשר חסרים את קולטן המשותף tdgf1 Nodal חיוני23,לא הצליח להרחיב בתגובה הזרקת ndr2 (איור 2E),המוכיח כי פעילות Nodal היא קריטית עבור זה ex vivo morphogenesis. בנוסף, הר שלם בהכלאה במקום הראה עוד כי ndr2- ביטוי explants לבטא סמנים של neuroectoderm (sox2) וכמה תת סוגים מסודרם (tbxta, noto, tbx16) (איור 2G),כמו גם אנדודרם ואת המארגן העוברי20. איתות נודל אינו נדרש עבור אינדוקציה neuroectoderm על ידי mesodermפעילות איתות נודאל חיונית לאינדוקציה של אנדודרם ורוב mesoderm אבל הוא ניתן לוותר על מפרט neuroectoderm בתוך gastrulae דג זברה23,24. בעוד explants blastoderm דגי זברה לא נבדלו לנוירוקטודרם (איור 3C18),explants מעוברים מוזרקים עם 10 pg ndr2 הציג ביטוי חזק של sox סמן neuroectoderm בפסים נפרדים לאורך הציר הארוך של explant (איור 2G),המציין כי פעילות נודל נדרשת להיווצרות neuroectoderm ex vivo. זה כבר זמן רב ידוע כי רקמות מזודרמליות יכול לגרום לרקמה עצבית25,26,27,28,29, כולל ב blastoderm דג זברה explants17. עם זאת, לא ברור אם היווצרות נוירוקטודרם במערכת זו explant דורש נודל איתות ישירות או אם ליגנדים נודאל אקסוגני לגרום mesoderm כי אז גורמת רקמות עצביות משנית. הסברים כימריים המכילים חלקים מסודרמים ונוירוקטודרמים פוטנציאליים משני עוברים שונים נוצרו כדי לבדוק אם איתות נודאל נדרש באופן אוטונומי לרקמה אוטונומית עבור מפרט נוירוקטודרם ex vivo. החלק המסודרם של כל מסלק נחתך מעובר WT אחר המבטא כתב GFP מהונדס ספציפי למסודרם, Tg[lhx1a:eGFP]30,מוזרק עם מינון גבוה (100 pg) של ndr2 (איור 3A). חלק הנוירוקטודרם הפואטי של כל הסבר נחתך מעובר WT בקרה או מעובר נדאל איתות חסר MZoep-/- עובר מוזרק רק עם mRNA קידוד הסמן הגרעיני פלואורסצנטי H2B-RFP (איור 3A). כל הסבר כימרי נוצר על ידי שילוב של blastoderm אחד מכל אחד משני התנאים האלה, אשר נידונו לביטוי של סמנים ספציפיים לרקמות על ידי הר שלם בהכלאה במקום ב 12 כ”ס. רוב המסלקים העובר הבודד מעוברים שהוזרקו עם 100 pg ndr2 הביעו מעט או לא סוקס2,וביטאו סמנים של מסודרם, כולל tbxta ו- lhx1a:gfp כתב – לאורך כל ההסבר(איור 3B,G). blastoderm WT uninjected (מהסוג הכולל את החלק הנוירוקטודרמי הפוטנציאלי של explants כימרית) לא הביע לא סמנים mesoderm ולא sox2 כאשר מתורבת כמו explant יחיד, המציין חוסר נוירוקטודרם מפרט מזודרם (איור 3C,H). לעובר יחיד חסר ביטוי של שניסמני נוירוקטודרם ומסודרמה, גם כאשר מוזרקים להם ndr2 (איור 3D). עם זאת, כאשר פיצוץ WT uninjected שולבו עם mesoderm המושרה על ידי מינונים גבוהים של ליגנדים Nodal, אלה explants כימרי ביטא הן סמנים mesoderm ו sox2 בחוזקה(איור 3E,אני). תוצאות אלה מראות כי, כפי שנצפה בעבר17,26,27,29, mesoderm יכול לגרום לגורל עצבי בתאים שאחרת יהפכו לא עצביים ectoderm. כדי לבדוק אם איתות נדאל נדרש ישירות בתוך החלק הנוירוקטודרמי הפוטנציאלי של explants אלה עבור אינדוקציה עצבית שלהם, explants כימרי נוצרו מ blastoderms WT מוזרק עם 100 pg ndr2 ו blastoderms מ MZoep-/- עוברים(איור 3J). למרות חוסר יכולתם לקבל אותות נודאל מהחלק המזודרמלי השכן, הסברים אלה הביעו sox2 במידה דומה כמו כימרות בקרת WT(איור 3F). תוצאה זו מדגימה כי בקנה אחד עם עוברים שלמים שבהם רקמות עצביות מצוינות בהיעדר פעילות Nodal, איתות Nodal אינו נדרש רקמה-אוטונומית עבור אינדוקציה neuroectoderm אינדוקציה ex vivo. איור 1: הליך להסברת blastoderm של דגי זברה (שלב 4.3). (A)החזק את המלקחיים ביד הלא דומיננטית (כתומה) סגורים כנגד החלמון כדי לייצב את העובר תוך צביטת הפיצוץ בערך חצי מגובהו באמצעות המלקחיים ביד הדומיננטית (כחול). (B)הפעל את המלקחיים הכתומים לאורך קצה המלקחיים הכחולים אוחזים בעובר כדי לחתוך את הפיצוץ כך שהחתך הראשון יגיע בערך באמצע הפיצוץ. (C)לסובב את העובר 90°, ולאחר מכן למקם את המלקחיים הכחולים בפנים (אבל אורתוגונל ל) החתך המקורי לצבוט כדי לנתק את blastoderm הנותר. (D)אפשר לתאי blastoderm מוסברים להחלים בפתרון של 3x Danieau במשך כ -5 דקות לפני המעבר למדיה מסבירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2 (שונה מ-20):ליגנדים נודאל מקדמים מורפוגנזה C&E ויצירת שכבת נבטים בגידולי פיצוץ דגי זברה. (A)תרשים של הזרקה והסברה של עוברים של דגי זברה. (B-E) תמונות שדה בהיר מייצגות של explants חי blastoderm של התנאים שצוינו / גנוטיפים בשלב שווה ערך 2-4 סומיט שלב. N = מספר explants משניים לארבעה ניסויים עצמאיים. (ו)סדרת DIC לשגות זמן של explant נציג מעובר WT מוזרק עם 10 pg ndr2 RNA. (ז) תמונות מייצגות של כל ההר בהכלאה במקום עבור התמלילים המצוינים explants מעוברי WT מוזרק עם 10 pg ndr2 RNA. סרגלי קנה המידה הם 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3 (שונהמ-31):הסברים כימריים חושפים כי מפרט נוירוקטודרם אינו דורש דיאגרמת נודאל אוטונומית של רקמות. (A)דיאגרמה של ההליך ליצירת תפארת דגי זברה כימריים. (B-F) הרכבה מלאה בהכלאה במקום עבור סמן mesoderm tbxta (למעלה) וסמן נוירוקטודרם sox2 (למטה) ב explants מעוברי WT מוזרק עם 100 pg ndr2 RNA(B),פקדי WT uninjected (C), MZoep-/- מוזרק עם 10 pg ndr2 (D),ו explants כימרי המכילים חלקים neuroectoderm מ WT (E) אוOEPMZ -/ – (F ) עוברים בשלב הסומיט 2-4. שברים מציינים את מספר explants עם פנוטיפ המוצג על המספר הכולל של explants שנבדקו. (G-J) תמונות מייצגות של צילומי Blastoderms חיים של Tg [lhx1a:gfp] מעובר יחיד (G-H) או בשילוב עם פיצוץ המבטא H2B(I-J, magenta) של התנאים המצוינים שווה ערך לשלב הסומיט 2-4. N = מספר המסלקים משלושה ניסויים עצמאיים. סרגלי קנה המידה הם 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. פתרון 1 פתרון 2 פתרון 3 פתרון 4 תמיסה 3x דניאו מי ביצים מדיה מסבירה 0.3x דניאו מרכיבים 174 מ”מ נקל 60 מיקרוגרם / מ”ל מלחי ים DMEM/F12 + 2.5 מ”מ ל-גלוטמין ו-15 מ”מ HEPES 17.4 מ”מ נקל 2.1 מ”מ KCl 1 L מים מזוקקים 3% מהנפח הכולל של סרום עגל שזה עתה נולד או סרום בקר עוברי 0.21 מ”מ KCl 1.2 מ”מ MgSO4. 7H2O 1:200 פניצילין (50 יחידות/מ”ל)-סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם/מ”ל) 0.12 מ”מ MgSO4•7H2O 1.8 מ”מ Ca(NO3)2 •4H2O 0.18 מ”מ Ca(NO3)2 •4H2O 15 מ”מ HEPES דוגמה: 1.5 מ”מ HEPES מים מזוקקים 4 מ”ל/תנאי x 9 תנאים = 36 מ”ל מים מזוקקים סרום עגל שזה עתה נולד ב-1.08 מ”ל (NCS, עם 20 °C (3%) 0.18 מ”ל 200x פן-סטרפטוקוף (נ.ב., עלי ב-20 °C))(1:200) 35 מ”ל DMEM/F12 טבלה 1.

Discussion

מאמר זה תיאר כיצד ליצור explants blastoderm דג זברה ודן בשני יישומים מעשיים של explants אלה בטיפול בתפקיד של Nodal מורפוגן איתות גסטרולציה. שיטה זו של חיתוך ו culturing explants מספק צפחה ריקה של תאים נאיביים שניתן לתמרן באמצעות זריקות RNA וטיפול עם תרכובות מולקולה קטנות כדי לחקור מסלול מולקולרי של עניין.

צעדים קריטיים
ישנם ארבעה שלבים בפרוטוקול זה שהם קריטיים במיוחד להצלחתו. הראשון הוא הזרקת העוברים עם הכמות המתאימה של נדאל. פרוטוקול זה ממליץ 10 pg של ndr2 RNA, ולמרות מגוון של מינונים מקדם הרחבה, יותר מדי או מעט מדי Nodal ימנע הרחבה explant אופטימלי20. השלב השני הוא פירוק העוברים. אם העוברים יישארו בפרונאז זמן רב מדי, החלמונים יתפוצצו, והעוברים לא יהיו בני קיימא לחיתוך. אם הם לא בפרונאז מספיק זמן, chorions לא ישוחררו על ידי כביסה ובמקום זאת ידרוש dechorionation ידני זמן רב. הצעד הקריטי השלישי הוא לחתוך את ההסברים. מומלץ לחתוך את הפתרון של Danieau 3x, שכן תכולת המלח הנמוכה יותר של 0.3x הפתרון או מי הביצים אינה מקדמת ריפוי והישרדות של explants.

בנוסף, יש לחתוך את explants בערך חצי מגובה הפיצוץ כדי להבטיח את הנאיביות של התאים. אם הם נחתכים קרוב מדי לחלמון, הם יכילו אותות מהשוליים (כולל נודל אנדוגני) המקדמים מפרט רקמות ומורפוגנזה. השלב הקריטי הרביעי והאחרון הוא בריפוי של explants כימרי. שני explants לא להתמזג כדי ליצור כימרות אלא אם כן הקצוות החתוכים שלהם נלחצים בעדינות יחד מיד לאחר שהם נחתכים.

שינויים ופתרון בעיות
השלבים הקריטיים המתוארים לעיל מספקים הזדמנויות לפתרון בעיות. להלן כמה בעיות נפוצות ופתרונות מוצעים.

אם explants אינם מתרחבים בנוכחות איתות Nodal, ישנם כמה פתרונות אפשריים. (A) הזרק עוברים בשלב התא הבודד כדי להבטיח שהרנ”א מפוזר באופן שווה בכל העובר. (B) הימנע הזרקת יותר מדי RNA nodal על ידי הבטחת כי נפח מוזרק נכון באמצעות מיקרומטר כדי למדוד את בולוס הזרקה. (C) הימנע הזרקת מעט מדי RNA nodal על ידי מדידת הריכוז שלה כדי להבטיח שהוא לא הושפל. (ד) שמור כמה אחים שלמים תואמי גיל כדי להסיק את השלב המקביל של explants. Explants להשיג הרחבה מקסימלית כאשר אחים שלמים להגיע לשלב 2-5 סומיט. אם explants נאספים מוקדם מדי, אז ההרחבה האופטימלית לא תגיע.

אם החלמונים מתפוצצים לאחר dechorionation, ואת העוברים אינם קיימא לחתוך, להסיר את העוברים מפתרון פרונאז פעם הכוריות מתחילות לקרוץ ו 1-2 עוברים לשפוך את chorion שלהם. לאחר מכן, יש לשטוף מיד במי ביצים.

אם המהללים נראים תוססים סביב הקצוות, יש כמה פתרונות. (א) לחתוך explants רק בתוך מסגרת זמן ספציפית של פיתוח. למרות ש-explants שנחתכים בכל שלב משלבים של 128 עד 1000 תאים יכולים לשרוד ולהשתרע בתרבות, אלה שנחתכים בשלבים של 256 עד 512 תאים נוטים להיות החזקים ביותר. (B) ודא כי explants נחתכים בפתרון של 3x Danieau כדי להבטיח ריפוי נכון. (ג) חותכים את המסלקים בצורה נקייה אך בעדינות. הימנע מתיחה או משיכת התאים לגזרים במהלך תהליך החיתוך.

אם מרחיבים את שליטה לא מושקעת, סביר להניח שההפקות היו חותכות קרוב מדי לחלמון. כדי שההפקות יהיו תמימות, ודאו שהקיצוצים נעשים באמצע הדרך בין החלמון לחלק העליון של הבלאסטודרם.

אם explants כימרית לא להתמזג, סביר להניח כי הנטייה של explants בפתרון של 3x Danieau פעם לחתוך הוא לאסוף ולהחלים על הקצה לחתוך. כדי להבטיח כי שתי blastoderms לרפא אחד את השני ולא את עצמם, לחץ אותם יחד מיד לאחר חיתוך. השתמש במלקחיים כדי להפעיל לחץ עדין על ההפצות החדשות שהצטרפו בתוך הבאר כדי לעודד אותם להחלים יחד.

מגבלות
בעוד explants אלה הם כלי רב ערך ללמוד את התפקיד של מורפוגן נתון (או מולקולה אחרת של עניין) בבידוד יחסי, תצפיות שנעשו בכל מודל ex vivo חייב להתפרש בזהירות. Explants התערוכה C&E מורפוגנזה כי הוא דומה מאוד לזה שנצפו ב vivo20, אבל הם לא recapitulate כל ההיבטים של גסטרולציה, למשל, תנועות אפיבולי. הם גם חסרים גורמים רגולטוריים רבים אחרים ומולקולות איתות הנמצאות בתוך עובר שלם. אמנם זהו יתרון ניסיוני משמעותי של explants, זה יכול גם להוביל למסקנות שאינן מחזיקות ויוו. לדוגמה, מאז explants שאינם מקבלים ליגנדים נודאל אקסוגני להיכשל לבטא סמני neuroectoderm, אפשר להסיק מן explants לבד כי איתות Nodal נדרש מפרט neuroectoderm. עם זאת, neuroectoderm נוצר בתוך עוברים שלמים חסר כל Nodal איתות23,24, מדגים את התפקיד החיוני של מולקולות איתות אחרות במפרט עצבי32. Explants יכול לספר לנו מה מורפוגן מסוגל בסביבה מבודדת. ובכל זאת, כל הממצאים כאלה צריכים להיות מאושרים / לעומת עוברים שלמים כדי שהתוצאות יתפרשו ביסודיות. במילים אחרות, explants לא יכול לתפוס את מקומו של עובר מתפתח. במקום זאת, הם כלי משלים כדי לזהות את התפקיד ואת היחסים של מורפוגן עם הסביבה. עם מגבלות אלה בחשבון, explants blastoderm דגי זברה הם כלי בעל ערך לשאלות מחקר רבות.

משמעות ביחס לשיטות קיימות
עם עניין מחודש בעוברים סינתטיים, מספר גישות ex vivo ו במבחנה משמשים באופן קבוע מודל היבטים של התפתחות עוברית. לדוגמה, gastruloids 2-ו 3-dimensional המורכב עכבר או תאי גזע עובריים אנושיים / המושרה pluripotent ניתן לפתות, באמצעות יישום של מולקולות איתות אקסוגני, כדי לשחזר חלק דפוס ו / או אירועים מורפוגנטיים של גסטרולציה, פילוח, ו neurulation33,34,35,36,37 . למרות עוצמה, שיטות אלה דורשות שיטות תרבות מייגעות וממושכות הן לשמור ברציפות על תאי גזע פלוריפוטנטים והן לגדל gastruloids, אשר לוקח ימים רבים כדי להגיע לשלבי גסטרולציה. לעומת זאת, תפירות דגי זברה אינן דורשות תחזוקה של תרביות תאי גזע, שכן עוברים פשוט נאספים לפי הצורך. הם פשוטים יחסית כדי ליצור ולהגיע לשלבי גסטרול בתוך שעות, זהה עוברים דג זברה. זה מדגיש יתרון נוסף של explants דגי זברה, השעון ההתפתחותי שלהם שלם. מכיוון שהעידן ההתפתחותי של תאי גזע עובריים ומושרים יכול להיות משתנה ושנוי במחלוקת, explants עובריים אולי מתאימים יותר לחקור ויסות זמני של התפתחות. לבסוף, בעוד explants דג זברה פסקואיד (המכילים את השוליים העובריים) באופן דומה להרחיב בתרבות12,13, הם עושים זאת בתגובה למרכזי איתות אנדוגני. במקום זאת, explants המתואר כאן לאפשר לחוקרים לחקור מולקולות עניין עם הפרעות מעטות יחסית מאותות עובריים כאלה.

יישומים עתידיים פוטנציאליים
כאן, explants שימשו כדי להוכיח כי איתות Nodal הוא הכרחי מספיק עבור מורפוגנזה C&E. עם זאת, הוא צפוי כי הם יכולים וישמשו כדי להבחין בתפקיד של מולקולות רבות ושונות בתהליכים התפתחותיים רבים אחרים, למשל, ויסות של ביטוי גנים, שיפועי איתות, ותוכניות מורפוגנטיות נוספות. בנוסף, מכיוון ש explants אלה הם קיימא עד לפחות 24 כ”ס19, ניתן לצפות כי השירות שלהם יתרחב מעבר gastrulation לתהליכים כגון סגמנטציה organogenesis, כל תהליך שבו החוקרים רוצים צפחה ריקה התפתחותית.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי NICHD R00HD091386 ל- MLKW ועל ידי NIEHS T32ES027801 ל- AAE.

Materials

1 mm glass beads Millipore-Sigma Z250473
4% Paraformaldehyde VWR J19943-K2
6-well plates Fisher FB012927
Agarose Thermo-Fisher 16500500
Ca(NO3)2 .4H2O Thermo-Fisher 12364-36
DMEM/F12 media Gibco 11330032
Dumont #5 watchmakers forceps World Precision Instruments 500341
Embryo injection mold Adaptive Science Tools I-34
Glass crystalizing dishes Fisher 08-741A
Glass Petri dishes Fisher 08-748A
HEPES VWR JT4018-1
Instant Ocean sea salts Instant Ocean SS15-10
KCl VWR BDH9258-500G
Low temperature incubator Fisher 15-015-2632
MgSO4.7H2O VWR 97062-134
Microloader pipette tips Eppendorf 930001007
Micromanipulator World Precision Instruments M3301R
Micrometer SPI supplies 02265-AB
Mineral oil VWR MK635704
NaCl VWR BDH9286-500G
Newborn Calf Serum Invitrogen 26010-066
Pasteur pipettes Fisher 13-678-30
Penicillin-Streptomycin Solution Thermo-Fisher 15140122
Pico-pump pneumatic injector World Precision Instruments SYS-PV820
Pipet pump Fisher 13 683C
Plastic Petri dishes 100 mm Fisher FB0875712
Plastic Petri dishes 60 mm Fisher FB0875713A
Plastic wash bottles Fisher 03-409-10E
Pronase Millipore-Sigma 10165921001
Tween-20 VWR 200002-836
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm. Cell. 71 (5), 731-739 (1992).
  2. Sudarwati, S., Nieuwkoop, P. D. Mesoderm formation in the anuranXenopus laevis (Daudin). Wilhelm Roux Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (3), 189-204 (1971).
  3. Gurdon, J. B., Fairman, S., Mohun, T. J., Brennan, S. Activation of muscle-specific actin genes in Xenopus development by an induction between animal and vegetal cells of a blastula. Cell. 41 (3), 913-922 (1985).
  4. Keller, R., Danilchik, M. Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis. Development. 103 (1), 193-209 (1988).
  5. Ariizumi, T., et al. Isolation and differentiation of Xenopus animal cap cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2009).
  6. Asashima, M., Grunz, H. Effects of inducers on inner and outer gastrula ectoderm layers of Xenopus laevis. Differentiation. 23 (3), 206-212 (1983).
  7. Jones, E. A., Woodland, H. R. Development of the ectoderm in Xenopus: tissue specification and the role of cell association and division. Cell. 44 (2), 345-355 (1986).
  8. Keller, R. E. Vital dye mapping of the gastrula and neurula of Xenopus laevis. I. Prospective areas and morphogenetic movements of the superficial layer. Biología del desarrollo. 42 (2), 222-241 (1975).
  9. Sokol, S., Wong, G. G., Melton, D. A. A mouse macrophage factor induces head structures and organizes a body axis in Xenopus. Science. 249 (4968), 561-564 (1990).
  10. Thomsen, G., et al. Activins are expressed early in Xenopus embryogenesis and can induce axial mesoderm and anterior structures. Cell. 63 (3), 485-493 (1990).
  11. Howard, J. E., Smith, J. C. Analysis of gastrulation: different types of gastrulation movement are induced by different mesoderm-inducing factors in Xenopus laevis. Mechanisms of Development. 43 (1), 37-48 (1993).
  12. Fulton, T., et al. Axis specification in Zebrafish is robust to cell mixing and reveals a regulation of pattern formation by morphogenesis. Current Biology. 30 (15), 3063-3064 (2020).
  13. Schauer, A., Pinheiro, D., Hauschild, R., Heisenberg, C. -. P. Zebrafish embryonic explants undergo genetically encoded self-assembly. eLife. , 55190 (2020).
  14. Oppenheimer, J. M. The development of isolated blastoderms of Fundulus heteroclitus. The Journal of Experimental Zoology. 72 (2), 247-269 (1936).
  15. Trinkaus, J. P., Drake, J. W. Exogenous control of morphogenesis in isolated Fundulus blastoderms by nutrient chemical factors. The Journal of Experimental Zoology. 132 (2), 311-347 (1956).
  16. Grinblat, Y., Lane, M. E., Sagerström, C., Sive, H. Analysis of zebrafish development using explant culture assays. Methods in Cell Biology. 59, 127-156 (1999).
  17. Sagerström, C. G., Grinblat, Y., Sive, H. Anteroposterior patterning in the zebrafish, Danio rerio: an explant assay reveals inductive and suppressive cell interactions. Development. 122 (6), 1873-1883 (1996).
  18. Sagerström, C. G., Gammill, L. S., Veale, R., Sive, H. Specification of the enveloping layer and lack of autoneuralization in zebrafish embryonic explants. Devolopmental Dynamics. 232 (1), 85-97 (2005).
  19. Xu, P. F., Houssin, N., Ferri-Lagneau, K. F., Thisse, B., Thisse, C. Construction of a vertebrate embryo from two opposing morphogen gradients. Science. 344 (6179), 87-89 (2014).
  20. Williams, M. L. K., Solnica-Krezel, L. Nodal and planar cell polarity signaling cooperate to regulate zebrafish convergence and extension gastrulation movements. eLife. 9, (2020).
  21. de Olivera-Melo, M., Xu, P. F., Houssin, N., Thisse, B., Thisse, C. Generation of ectopic morphogen gradients in the Zebrafish blastula. Methods in Molecular Biology. 1863, 125-141 (2018).
  22. Sepich, D. S., Calmelet, C., Kiskowski, M., Solnica-Krezel, L. Initiation of convergence and extension movements of lateral mesoderm during zebrafish gastrulation. Devolopmental Dynamics. 234 (2), 279-292 (2005).
  23. Gritsman, K., et al. The EGF-CFC protein one-eyed pinhead is essential for nodal signaling. Cell. 97 (1), 121-132 (1999).
  24. Feldman, B., et al. Zebrafish organizer development and germ-layer formation require nodal-related signals. Nature. 395 (6698), 181-185 (1998).
  25. Spemann, H., Manngold, H. Uber inducktion von embryoalanlangen durch implantation artfremder organisatoren. Archiv für mikroskopische Anatomie und Entwicklungsmechanik. 100, 599-638 (1924).
  26. Mangold, O. Über die Induktionsfähigkeit der verschiedenen Bezirke der Neurula von Urodelen. Naturwissenschaften. 21 (43), 761-766 (1933).
  27. Shih, J., Fraser, S. E. Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage. Development. 122 (4), 1313-1322 (1996).
  28. Agathon, A., Thisse, C., Thisse, B. The molecular nature of the zebrafish tail organizer. Nature. 424 (6947), 448-452 (2003).
  29. Tacke, L., Grunz, H. Close juxtaposition between inducing chordamesoderm and reacting neuroectoderm is a prerequisite for neural induction in Xenopus laevis. Cell Death and Differentiation. 24 (1), 33-43 (1988).
  30. Swanhart, L. M., et al. Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish. The International Journal of Developmental Biology. 54 (4), 731-736 (2010).
  31. Williams, M. L. K., Solnica-Krezel, L. A mesoderm-independent role for Nodal signaling in convergence & extension gastrulation movements. BioRxiv. , (2019).
  32. Londin, E. R., Niemiec, J., Sirotkin, H. I. Chordin, FGF signaling, and mesodermal factors cooperate in zebrafish neural induction. Biología del desarrollo. 279 (1), 1-19 (2005).
  33. Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
  34. Veenvliet, J. V., et al. Mouse embryonic stem cells self-organize into trunk-like structures with neural tube and somites. Science. 370 (6522), (2020).
  35. Beccari, L., et al. Multi-axial self-organization properties of mouse embryonic stem cells into gastruloids. Nature. 562 (7726), 272-276 (2018).
  36. Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582 (7812), 410-415 (2020).
  37. vanden Brink, S. C., et al. Single-cell and spatial transcriptomics reveal somitogenesis in gastruloids. Nature. 582 (7812), 405-409 (2020).

Tags

Zebrafish EmbryosNaive Blastoderm ExplantsEmbryonic SignalingEx-vivo SystemNdr2 RNA Injection128-cell StageDechorionationPronase Treatment3X Danieau’s Solution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Alaniz Emig, A., Williams, M. L. K. Generation of Naïve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (173), e62797, doi:10.3791/62797 (2021).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image