Generatie van naïeve Blastoderm Explants uit Zebravis Embryo's

1 Bereid de reagentia en benodigdheden voor Reagens voorbereiding Bereid 500 ml 3x Danieau’s oplossing (oplossing 1, tabel 1). Bereid 1 L eiwater (oplossing 2, tabel 1). Bereid een 1,2% oplossing van agarose in eiwater. Smelt de agarose volledig in de magnetron en laat vervolgens afkoelen tot 55 °C in een waterbad. Bereid 4 ml explantmedia (oplossing 3, tabel 1,licht gewijzigd van19,21) per experimentele toestand.OPMERKING: Vergeet niet om rekening te houden met ten minste één put explantaten van niet-geïnjecteerde (of controle geïnjecteerde) embryo’s bij het berekenen van het vereiste volume. Ontsmet de werkruimte met 70% ethanol. Verwijder celkweekmedia van 4 °C en spuit/doek met 70% ethanol. Maak explantmedia en plaats ze in de incubator van 28,5 °C om op te warmen terwijl de embryo’s worden geïnjecteerd.OPMERKING: Voeg altijd leeftijdsgematchte, intacte embryo’s van broers en zussen toe voor stadiëringsdoeleinden. Dechorioneer deze embryo’s en kweek ze op agarose-gecoate platen in 0,3x Danieau’s oplossing (oplossing 4, tabel 1). Verwijder pronase aliquots (1 ml bij 20 mg/ml) van -20 °C en laat ontdooien op ijs. Ontdooi één aliquot van 1 ml voor elke drie experimentele omstandigheden. Bereid agarose borden Maak de injectieplaten. Vul een plastic petrischaaltje van 100 mm x 15 mm halverwege met gesmolten agarose in eiwater. Plaats de spuitgietmatrijs voorzichtig bovenop de gesmolten agarose in een hoek van 45° en laat deze geleidelijk in de agarose zakken, zodat er geen bubbels onder vast komen te zitten. Laat het helemaal afkoelen. Verwijder de vorm. Gebruik de plaat onmiddellijk of bewaar voor later door 2 ml eiwater toe te voegen, de plaat te omwikkelen en bij 4 °C te bewaren. Verwarm de plaat gedurende 15-30 minuten in de incubator van 28,5 °C vóór de injectie. Maak explant snijplaten. Voeg 3 ml gesmolten 1,2% agarose in eiwater toe aan een petrischaaltje van 60 mm x 15 mm en zorg ervoor dat de hele bodem van de put is bedekt. Laat het helemaal afkoelen. Bedek cultuurplaten met agarose. Geef voor elke experimentele toestand 1 ml gesmolten 1,2% agarose in eiwater af in één put van een plaat met 6 putten, zodat de hele bodem van de put is bedekt. Laat het helemaal afkoelen. Voor het maken van chimere explants, maak een explant snijschaal met kleine putjes door twaalf 1 mm glasparels toe te voegen aan gesmolten agarose in een petrischaaltje van 60 mm x 15 mm. Verwijder de kralen met een tang zodra de agarose volledig is afgekoeld. 2 Injecteer embryo’s met RNA Verwijder met handschoenen aan een hoeveelheid synthetisch ndr2 mRNA uit de opslag bij -80 °C en plaats deze onmiddellijk op ijs. Bereid de injectienaald voor. Vul een getrokken glazen capillaire naald met RNA. Plaats de gevulde naald in een micromanipulator en breek de punt van de naald met een tang. Kalibreer het injectievolume met behulp van een trapmicrometer met een druppel minerale olie, waarbij de injectietijd en druk op de pneumatische injector worden aangepast om een bolus van de gewenste grootte te bereiken. Een bolus met een diameter van 120 μm heeft een volume van 1 nL.OPMERKING: Het gewenste volume van de bolus is afhankelijk van de concentratie van het RNA en de gewenste dosis per embryo. Als RNA bijvoorbeeld aliquoteert bij 10 ng / μL, injecteer dan 1 nL om een uiteindelijke hoeveelheid van 10 pg te bereiken. Houd de punt van de RNA-naald ondergedompeld in de olie totdat deze klaar is om te injecteren. Laad de embryo’s en injecteer. Trek de verdelers in kweektanks, laat vissen 10-15 minuten spawnen en verzamel de embryo’s met behulp van een theezeef. Laad de embryo’s in de injectieplaat met behulp van een Pasteur pipet en pipetpomp en gebruik vervolgens een gehandschoende vinger om de eieren voorzichtig in de troggen te drukken. Injecteer 10 pg ndr2 RNA in de dooier van eencellige embryo’s totdat het gewenste aantal embryo’s is bereikt of totdat embryo’s zich beginnen te delen.OPMERKING: Injecteer niet na het eencellige stadium om een gelijkmatige verdeling van het RNA door het embryo te garanderen. Spoel de embryo’s uit de injectieplaat in een gelabelde petrischaal van 100 mm x 15 mm met een zachte stroom eiwater uit een knijpfles.OPMERKING: Houd altijd een groep leeftijdsgematchte, niet-geïnjecteerde broers en zussen als controle. Plaats de embryo’s in de couveuse van 28,5 °C totdat ze het stadium met 128 cellen bereiken. Verwijder onbevruchte eieren en dode embryo’s uit het gerecht. 3 Dechorioneer de embryo’s Zodra de embryo’s het stadium van 128 cellen hebben bereikt, plaatst u ze in gelabelde glazen petrischalen en decanteert u er zoveel mogelijk eiwater uit. Label glazen kristalliserende schotels met laboratoriumtape (overeenkomend met kleine schotelnamen) en vul 2/3 van de weg met eiwater. Plaats deze gerechten naast de ontleedmicroscoop voor snelle toegankelijkheid. Voeg 1 ml pronasebouillon (20 mg /ml, ontdooid op ijs) toe aan 15 ml 3x Danieau’s oplossing in een conische buis van 50 ml.OPMERKING: Deze hoeveelheid is voldoende voor maximaal drie experimentele omstandigheden. Verhoog het volume van pronase en 3x Danieau’s oplossing voor extra explantomstandigheden.LET OP: Pronase is irriterend; draag daarom handschoenen bij het hanteren. Voeg ten minste 5 ml pronase-oplossing toe aan elke glazen petrischaal met embryo’s. Roer de glazen schalen in een cirkelvormige beweging en controleer de voortgang van de verjaring consequent onder een ontleedmicroscoop. Zodra de chorions beginnen te rimpelen en 1-2 embryo’s uit hun chorions zijn, dompelt u voorzichtig de glazen petrischaal met pronase en de embryo’s in de overeenkomstige glazen kristalliserende schaal met eiwater. Was de ontchorioneerde embryo’s. Was de embryo’s drie keer met eiwater door voorzichtig eiwater uit de schaal toe te voegen en vervolgens te decanteren. De derde en laatste wasbeurt is met 0,3x Danieau’s oplossing.OPMERKING: Als de embryo’s na het wassen nog steeds chorions hebben, pipetteer de embryo’s dan voorzichtig totdat de chorions zijn verwijderd of laat ze een minuut of twee in de was (eiwater of 0,3x Danieau’s oplossing) zitten en roer voorzichtig met cirkelvormige bewegingen. Dek de embryo’s af met een petrischaaldeksel en breng ze terug naar de couveuse (28,5 °C) totdat ze het stadium met 256 cellen bereiken. 4 Snij explantaten Vul de met agarose beklede petrischaal van 60 mm x 15 mm met 3x Danieau’s oplossing. Zodra de embryo’s zich in het stadium van 256 cellen bevinden, breng je ze over in de met agarose bedekte plaat met 3x Danieau’s oplossing en zet je ze langs het midden van de schaal. Knip de explants met een tang(figuur 1). Gebruik een tang, gesloten gehouden, om het embryo te stabiliseren en gebruik de andere om door het blastoderm te snijden op ongeveer de helft van de hoogte (van marge tot dierenpaal) (Figuur 1A). Om te snijden, knijp je voorzichtig in de blastodermcellen met één tang. Neem vervolgens de stabiliserende tang en laat ze langs de andere tang lopen om ongeveer halverwege het blastoderm te snijden (figuur 1B). Draai het embryo, plaats de tang in de bestaande snede en snijd vervolgens het resterende blastoderm orthogonaal door naar de eerstesnede (figuur 1C). Bewaar explantaten in 3x Danieau’s oplossing gedurende ten minste 5 minuten om te genezen en breng ze vervolgens over naar de put van een 6-well plaat bedekt met agarose en gevuld met 4 ml explant media.OPMERKING: Knip explantaten van niet-geïnjecteerde (of controle geïnjecteerde) broers en zussen als negatieve controles. Als explantaties correct worden uitgevoerd, zullen deze explants geen markers van endoderm, mesoderm of neuro-ectoderm uitbreiden of uitdrukken. Plaats de explantcultuurplaten in de incubator van 28,5 °C totdat het gewenste tijdspunt/stadium (bepaald aan de hand van intacte broers en zussen) is bereikt.OPMERKING: Bij behandeling van explantaten met een verbinding, zoals een kleine molecuulremmer, kan de gewenste concentratie direct worden toegevoegd aan de explantmedia in de putten op de gewenste tijdstippen. Vergeet niet om het volume van agarose op te nemen bij het berekenen van concentraties. (Voorbeeld: 1 ml agarose + 4 ml explantmedia = 5 ml totaal volume per put). 5 Bereid chimere explantaten In plaats van een gewone agarose gecoate plaat, snijd chimere explantaten in een schaal met agarose gegoten in twaalf kleine, ondiepe putten met behulp van 1 mm glasparels (sectie 1.2.4). Vul dit bord met 3x Danieau’s oplossing.OPMERKING: Chimere explantaten worden gegenereerd uit blastodermcellen van twee embryo’s van verschillende genotypen of aandoeningen. Zorg ervoor dat deze aandoeningen van elkaar kunnen worden onderscheiden door de expressie van transgene of geïnjecteerde fluorescerende markers. Bereid je voor door twaalf embryo’s van één genotype/aandoening toe te voegen aan de linkerkant van de plaat en twaalf embryo’s van het andere genotype/aandoening aan de rechterkant van de plaat. Verplaats een embryo van elke aandoening naar het midden van de plaat, in de buurt van een van de 12 putten. Snijd met behulp van een tang een explant uit elk embryo zoals beschreven voor afzonderlijke embryo-explantaten (stap 4.3). Druk snel de snijkanten van de twee explants samen in de ondiepe put met een tang om de twee helften samen te laten genezen tot een enkele explant. Ga verder met de resterende elf putten binnen het bord. Zodra explants zijn genezen, breng je ze over naar de put van een 6-well plaat bedekt met agarose en gevuld met 4 ml explant media. Herhaal dit totdat het gewenste aantal explants is bereikt. 6 Cultuur en/of imago de vaste explants Kweek explanteert in de incubator van 28,5 °C totdat intacte embryo’s van broers en zussen het gewenste stadium bereiken. Live explants kunnen worden gemonteerd voor continue time-lapse beeldvorming, periodiek in beeld worden gebracht gedurende de kweekperiode of live worden afgebeeld op het experimentele eindpunt. Bevestig de explantaties indien gewenst. Zodra de explantaten het gewenste eindpunt bereiken, noteert u het stadium van intacte embryo-broers en zussen en plaatst u de explantaten in een glazen scintillatieflacon met 1 ml 4% paraformaldehyde in PBS. ‘s Nachts op een shaker op 4 °C.LET OP: Paraformaldehyde is giftig. Draag handschoenen bij het hanteren van deze chemische stof en gooi het weg via methoden die door elke instelling zijn goedgekeurd. Spoel na fixatie de explantatie zes keer, 15 minuten elk met PBS + 0,1% Tween-20, en drogeer geleidelijk uit tot methanol. Bewaar explantaten bij -20 °C voor latere analyse door de whole-mount in situ hybridisatie, immunofluorescente kleuring, enz.