Dette papiret gir en detaljert protokoll for å forberede prøvegitter ved temperaturer så høye som 70 ° C, før dypping for kryo-EM-eksperimenter.
Prøvegitterene for kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) eksperimenter fremstilles vanligvis ved en temperatur som er optimal for lagring av biologiske prøver, hovedsakelig ved 4 ° C og noen ganger ved romtemperatur. Nylig oppdaget vi at proteinstrukturen løst ved lav temperatur kanskje ikke er funksjonelt relevant, spesielt for proteiner fra termofil archaea. En prosedyre ble utviklet for å forberede proteinprøver ved høyere temperaturer (opptil 70 ° C) for kryo-EM-analyse. Vi viste at strukturene fra prøver fremstilt ved høyere temperaturer er funksjonelt relevante og temperaturavhengige. Her beskriver vi en detaljert protokoll for fremstilling av prøvegitter ved høy temperatur, med 55 °C som eksempel. Forsøket benyttet et vitrifikasjonsapparat modifisert ved hjelp av et ekstra sentrifugerør, og prøver ble inkubert ved 55 °C. De detaljerte prosedyrene ble finjustert for å minimere dampkondens og oppnå et tynt lag med is på rutenettet. Eksempler på vellykkede og mislykkede eksperimenter er gitt.
Kryo-EM-teknologien for å løse strukturene til proteinkomplekser har fortsatt å forbedre seg, spesielt i retning av å oppnå høyoppløselige strukturer 1,2. I mellomtiden har landskapet av applikasjonen også blitt utvidet ved å variere prøveforholdene som pH eller ligander før vitrifiseringsprosessen3, som innebærer fremstilling av prøvegitter etterfulgt av stupfrysing 4,5. En annen viktig betingelse er temperaturen. Selv om kryo-EM-eksperimenter, som røntgenkrystallografi, utføres ved lave temperaturer, reflekterer strukturen løst av cryo-EM strukturen ved løsningstilstanden før vitrifisering. Inntil nylig bruker flertallet av kryo-EM-studier (Single Particle Analysis) prøver som holdes på is (dvs. ved 4 ° C) før vitrifisering6, selv om en rekke studier bruker prøver ved rundt romtemperatur 7,8,9,10 eller så høyt som 42 ° C 11. I en fersk rapport utførte vi temperaturavhengige studier av enzymet ketolsyrereduktoisomerase (KARI) fra den termofile archaeon Sulfolobus solfataricus (Sso) ved seks forskjellige temperaturer fra 4 ° C til 70 ° C12. Våre studier tyder på at det er viktig å forberede prøvegitter ved funksjonelt relevante temperaturer, og at cryo-EM er den eneste strukturelle metoden som er praktisk gjennomførbar for å løse strukturen til det samme proteinkomplekset ved flere temperaturer.
Den største vanskeligheten for vitrifisering ved høye temperaturer er å minimere dampkondens og oppnå tynn is. Her rapporterer vi den detaljerte protokollen som ble brukt til å forberede prøvenett ved høye temperaturer i vår tidligere studie av Sso-KARI 12. Vi antar at leserne eller seerne allerede har erfaring med de generelle prøvepreparerings- og databehandlingsprosedyrene for kryo-EM-eksperimenter og legger vekt på aspektene som er relevante for høy temperatur.
I trinn 1 i protokollen må du kontrollere at sentrifugerøret er installert godt og ikke faller når eksperimentet pågår. På grunn av akkumulering av et stort antall vanndråper i kammeret, noe som kan endre adsorpsjonskapasiteten til filterpapiret, anbefales det at den totale tiden for forsøket ikke overstiger 30 minutter etter at vitrifikasjonsapparatkammeret nådde likevektstemperaturen. Hvis driftstiden overstiger 30 minutter, må operatøren bytte filterpapir og vente på at hytta balanserer temperatur og fukti…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Dr. Hervé Remigy fra Thermo Fisher Scientific for nyttige råd. Kryo-EM-eksperimentene ble utført ved Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM er støttet av Academia Sinica (Grant nr. AS-CFII-108-110) og Taiwan Protein Project (Grant nr. AS-KPQ-109-TPP2). Forfatterne takker også Hui-Ju Huang for hjelpen med prøveprepareringen.
Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
HI1210 | Leica | water bath | |
K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |