Dette papir giver en detaljeret protokol til forberedelse af prøvegitter ved temperaturer så høje som 70 ° C, inden nedfrysning til cryo-EM-eksperimenter.
Prøvegitterene til kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) eksperimenter fremstilles normalt ved en temperatur, der er optimal til opbevaring af biologiske prøver, for det meste ved 4 °C og lejlighedsvis ved stuetemperatur. For nylig opdagede vi, at proteinstrukturen løst ved lav temperatur muligvis ikke er funktionelt relevant, især for proteiner fra termofile arkæer. Der blev udviklet en procedure til fremstilling af proteinprøver ved højere temperaturer (op til 70 °C) til cryo-EM-analyse. Vi viste, at strukturerne fra prøver fremstillet ved højere temperaturer er funktionelt relevante og temperaturafhængige. Her beskriver vi en detaljeret protokol til forberedelse af prøvegitre ved høj temperatur ved hjælp af 55 °C som eksempel. Forsøget gjorde brug af et forglasningsapparat modificeret ved hjælp af et yderligere centrifugerør, og prøverne blev inkuberet ved 55 °C. De detaljerede procedurer blev finjusteret for at minimere dampkondensation og opnå et tyndt lag is på gitteret. Eksempler på vellykkede og mislykkede eksperimenter gives.
Kryo-EM-teknologien til løsning af strukturerne i proteinkomplekser er fortsat med at blive forbedret, især i retning af at opnå strukturer med høj opløsning 1,2. I mellemtiden er landskabet for dets anvendelse også blevet udvidet ved at variere prøvebetingelserne såsom pH eller ligander forud for forglasningsprocessen3, hvilket indebærer forberedelse af prøvegitter efterfulgt af springfrysning 4,5. En anden vigtig betingelse er temperaturen. Selvom cryo-EM-eksperimenter, som røntgenkrystallografi, udføres ved lave temperaturer, afspejler strukturen løst af cryo-EM strukturen ved opløsningstilstanden før vitrifikation. Indtil for nylig bruger størstedelen af enkeltpartikelanalyse (SPA) cryo-EM-undersøgelser prøver, der opbevares på is (dvs. ved 4 ° C) før vitrifikation6, selvom en række undersøgelser bruger prøver ved omkring stuetemperatur 7,8,9,10 eller så højt som 42 ° C 11. I en nylig rapport udførte vi temperaturafhængige undersøgelser af enzymet ketolsyrereduktoisomerase (KARI) fra den termofile arkæon Sulfolobus solfataricus (Sso) ved seks forskellige temperaturer fra 4 °C til 70 °C12. Vores undersøgelser tyder på, at det er vigtigt at forberede prøvegitter ved funktionelt relevante temperaturer, og at cryo-EM er den eneste strukturelle metode, der er praktisk mulig til at løse strukturen af det samme proteinkompleks ved flere temperaturer.
Den største vanskelighed ved forglasning ved høje temperaturer er at minimere dampkondensation og opnå tynd is. Her rapporterer vi den detaljerede protokol, der blev brugt til fremstilling af prøvegitter ved høje temperaturer i vores tidligere undersøgelse af Sso-KARI 12. Vi antager, at læserne eller seerne allerede har erfaring med den samlede prøveforberedelse og databehandlingsprocedurer for cryo-EM-eksperimenter og understreger de aspekter, der er relevante for høj temperatur.
I trin 1 i protokollen skal du sørge for, at centrifugerøret er installeret godt og ikke falder, når eksperimentet er i gang. På grund af akkumuleringen af et stort antal vanddråber i kammeret, som kan ændre filterpapirets adsorptionskapacitet, anbefales det, at eksperimentets samlede tid ikke overstiger 30 minutter efter, at vitrifikationsapparatets kammer nåede ligevægtstemperaturen. Hvis driftstiden overstiger 30 minutter, skal operatøren udskifte filterpapiret og vente på, at kabinen balancerer temperatur o…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Dr. Hervé Remigy fra Thermo Fisher Scientific for nyttige råd. Kryo-EM-eksperimenterne blev udført på Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM er støttet af Academia Sinica (Grant No. AS-CFII-108-110) og Taiwan Protein Project (tilskudsnr. AS-KPQ-109-TPP2). Forfatterne takker også fru Hui-Ju Huang for hjælpen med prøveforberedelsen.
Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
HI1210 | Leica | water bath | |
K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |