Congelación manual de muestras biológicas para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula

La microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (crioEM) es una poderosa técnica estructural que se puede utilizar para resolver estructuras de especímenes biológicos dinámicos a una resolución casi atómica1,2,3,4. De hecho, los recientes avances en las tecnologías de detectores directos de electrones4,5,6,7,8,9,10, las mejoras en las fuentes de electrones4,11,12,13,14 y ^la estabilidad de las lentes ^{electromagnéticas15}, junto con el desarrollo continuo de la adquisición de datos ^16,17 y los paquetes de software de ^{análisis18,19}, han permitido a los investigadores determinar ahora rutinariamente estructuras de especímenes de buen comportamiento a una resolución de 3 Å o mejor4,11,13,14,20,21,22,23 . A pesar de estas capacidades mejoradas de procesamiento de imágenes y datos, la preparación de la red cryoEM sigue siendo el mayor impedimento para la determinación exitosa de la estructura de alta resolución y, a menudo, sirve como un cuello de botella considerable en el flujo de trabajo de ^{EM24,25,26,27}.

CryoEM se basa en la obtención de imágenes de muestras biológicas en soluciones acuosas que se congelan para formar una película delgada de hielo “similar al vidrio”, un proceso conocido como vitrificación, que preserva el estado bioquímico nativo. La vitrificación de muestras biológicas para crioEM se remonta a más de 40 años28,29,30 y muchas técnicas y equipos que se han desarrollado para este proceso se basan en el método de blot-and-plunge originalmente detallado31,32,33,34,35 , mediante el cual se aplica un pequeño volumen de muestra (por ejemplo, 1-5 μL) a una rejilla EM especializada antes de eliminar el exceso de solución mediante la interacción física de la rejilla con papel secante. El momento de este proceso generalmente se determina empíricamente para cada espécimen, ya que un componente crítico de las muestras de congelación es el grosor de la película de hielo vítreo: si el hielo es demasiado grueso, la calidad de la imagen se deteriora dramáticamente debido al aumento de la dispersión del haz de electrones, mientras que el hielo que es demasiado delgado puede restringir las orientaciones de las proteínas y / o excluir partículas del centro de los orificios de la lámina de la ^rejilla36 . Esta dependencia del espesor de hielo perfecto para la crioEM de una sola partícula ha dado lugar a una amplia gama de técnicas y equipos que pueden congelar muestras, incluida la ^{robótica37,38}, la microfluídica42 y los dispositivos ultrasónicos o de pulverización27,39,40,41,42,43,44 . En los últimos años, algunos de los dispositivos de preparación de muestras más populares se basan en el uso de la robótica para la congelación automatizada de muestras utilizando la técnica de blot-and-plunge45. Si bien estos dispositivos están diseñados para crear de manera reproducible un espesor de hielo adecuado para las imágenes, a menudo siguen siendo demasiado caros para que los laboratorios individuales los compren y operen y generalmente se encuentran dentro de las instalaciones de crioEM a precios por hora para su uso. En los últimos años, la técnica manual original de blot-and-plunge ha vuelto a ser un uso cada vez mayor3,47,48,49,50,51,52. De hecho, un dispositivo de blot-and-plunge operado manualmente puede lograr rejillas crioEM de alta calidad a una fracción del costo de las contrapartes robóticas. Además, el blotting manual también ofrece a los usuarios más control sobre el blotting, ya que los investigadores pueden ajustar el tipo de blotting (es decir, el back-blotting de la cuadrícula, el front-blotting de la cuadrícula, etc.), y el tiempo de blotting en función de cada muestra individual y preguntas de investigación.

En este artículo, proporcionamos detalles sobre cómo congelar eficazmente muestras biológicas utilizando un dispositivo de vitrificación manual tradicional de borrado y inmersión junto con una plataforma dewar diseñada a ^medida53. Se proporcionan las mejores prácticas, incluida la preparación del criógeno, el manejo de la rejilla, la aplicación de muestras y el borrado, así como las trampas comunes y las recomendaciones sobre cómo superar estos obstáculos. Se discuten consejos sobre cómo aumentar la reproducibilidad del espesor del hielo entre las preparaciones de rejilla y cómo modificar el borrado de muestras en función del tipo de muestra biológica. Dado el bajo costo asociado con la compra y operación del émbolo manual descrito en este manuscrito, los laboratorios de todo el mundo pueden preparar especímenes biológicos para crioEM de una manera rentable y reproducible.