Congelamento manual de amostras biológicas para microscopia eletrônica criogênica de partículas únicas

Microscopia criogênica de elétrons de partículas únicas (crioEM) é uma técnica estrutural poderosa que pode ser usada para resolver estruturas de espécimes biológicos dinâmicos para resolução quase atômica1,2,3,4. De fato, os recentes avanços nas tecnologias diretas de detector de elétrons4,5,6,7,8,9,10, melhorias nas fontes de elétrons4,11,12,13,14, e estabilidade de lentes eletromagnéticas15, juntamente com o desenvolvimento contínuo da aquisição de dados ^16,17 e pacotes de software de ^{análise18,19}, permitiram aos pesquisadores determinar rotineiramente estruturas de espécimes bem comportados para resolução de 3 Å ou melhor 4,11,13,14,20,21,22,23 . Apesar desses recursos aprimorados de imagem e processamento de dados, a preparação da rede crioEM continua sendo o maior impedimento para uma determinação bem-sucedida da estrutura de alta resolução e muitas vezes serve como um gargalo considerável no fluxo de trabalho EM24,25,26,27.

O CrioEM baseia-se na imagem de amostras biológicas em soluções aquosas que são congeladas para formar uma fina película de gelo “semelhante a vidro” – um processo conhecido como vitrificação – que preserva o estado bioquímico nativo. A vitrificação de amostras biológicas para crioEM remonta a mais de 40 ^anos28,29,30 e muitas técnicas e equipamentos que foram desenvolvidos para este processo dependem do método originalmente detalhado de blot-and-plunge31,32,33,34,35 , pelo qual um pequeno volume de amostra (por exemplo, 1-5 μL) é aplicado a uma grade EM especializada antes que a solução em excesso seja removida usando interação física da grade com papel de mancha. O tempo deste processo é geralmente empiricamente determinado para cada espécime como um componente crítico das amostras de congelamento é a espessura do filme de gelo vítreo – se o gelo é muito grosso, então a qualidade da imagem se deteriora dramaticamente devido ao aumento da dispersão do feixe de elétrons, enquanto o gelo que é muito fino pode restringir orientações proteicas e/ou excluir partículas do centro dos buracos de papel alumínio ^{da grade36} . Essa dependência da espessura perfeita do gelo para crioEM de partículas únicas levou a uma ampla gama de técnicas e equipamentos que podem congelar amostras, incluindo ^{robótica37,38}, microfluidos42 e dispositivos ultrassônicos ou pulverizadores27,39,40,41,42,43,44 . Nos últimos anos, alguns dos dispositivos de preparação de amostras mais populares dependem do uso de robótica para congelamento automatizado de amostras usando a técnica de blot-and-plunge45. Embora esses dispositivos sejam projetados para criar de forma reprodutivelmente a espessura adequada do gelo para imagens, eles muitas vezes permanecem muito caros para laboratórios individuais comprarem e operarem e são geralmente encontrados dentro de instalações crioEM a taxas horárias para uso. Nos últimos anos, a técnica original de blot-and-plunge manual voltou a ser usada em aumento3,47,48,49,50,51,52. De fato, um dispositivo de blot-and-plunge operado manualmente pode alcançar grades crioEM de alta qualidade a uma fração do custo das contrapartes robóticas. Além disso, a mancha manual também oferece mais controle dos usuários sobre a mancha, pois os pesquisadores podem ajustar o tipo de mancha (ou seja, mancha traseira da grade, mancha frontal da grade, etc.), e tempo de mancha com base em cada amostra individual e questões de pesquisa.

Neste artigo, fornecemos detalhes sobre como congelar efetivamente amostras biológicas usando um dispositivo de vitrificação manual tradicional, juntamente com uma plataforma de guerra ^{personalizada53}. As melhores práticas, incluindo preparação do criogen, manuseio da grade, aplicação da amostra e manchas, bem como armadilhas e recomendações comuns sobre como superar esses obstáculos são fornecidas. São discutidos conselhos sobre como aumentar a reprodutibilidade da espessura do gelo entre as preparações da rede e como modificar a mancha de amostra com base no tipo de espécime biológico. Dado o baixo custo associado à compra e operação do êmbolo manual descrito neste manuscrito, laboratórios em todo o mundo podem preparar espécimes biológicos para crioEM de forma econômica e reprodutível.