Handmatige Blot-and-Plunge Freezing van biologische monsters voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje

Cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje (cryoEM) is een krachtige structurele techniek die kan worden gebruikt om structuren van dynamische biologische monsters op te lossen tot een bijna atomaire resolutie1,2,3,4. Inderdaad, recente ontwikkelingen in directe elektronendetectortechnologieën4,5,6,7,8,9,10, verbeteringen in elektronenbronnen4,11,12,13,14 en elektromagnetische ^{lensstabiliteit15}, gekoppeld aan de voortdurende ontwikkeling van gegevensverzameling ^16,17 en analysesoftwarepakketten18,19 hebben onderzoekers in staat gesteld om nu routinematig structuren van goed opgevoede monsters te bepalen tot een resolutie van 3 Å of beter4,11,13,14,20,21,22,23 . Ondanks deze verbeterde beeldvormings- en gegevensverwerkingsmogelijkheden blijft cryoEM-rastervoorbereiding de grootste belemmering voor succesvolle structuurbepaling met hoge resolutie en dient het vaak als een aanzienlijk knelpunt in de EM-workflow24,25,26,27.

CryoEM vertrouwt op de beeldvorming van biologische monsters in waterige oplossingen die worden ingevroren om een dunne film van “glasachtig” ijs te vormen – een proces dat bekend staat als vitrificatie – dat de inheemse biochemische toestand behoudt. Vitrificatie van biologische monsters voor cryoEM dateert van meer dan 40 jaar28,29,30 en veel technieken en apparatuur die voor dit proces zijn ontwikkeld, zijn gebaseerd op de oorspronkelijk gedetailleerde blot-and-plunge-methode31,32,33,34,35 , waarbij een klein volume monster (bijv. 1-5 μL) wordt aangebracht op een gespecialiseerd EM-raster voordat de overtollige oplossing wordt verwijderd met behulp van fysieke interactie van het raster met vloeipapier. De timing van dit proces wordt meestal empirisch bepaald voor elk monster, omdat een cruciaal onderdeel van vriesmonsters de dikte van de glasvochtijsfilm is – als het ijs te dik is, verslechtert de beeldkwaliteit dramatisch als gevolg van verhoogde verstrooiing van de elektronenbundel, terwijl ijs dat te dun is, eiwitoriëntaties kan beperken en / of deeltjes uit het midden van het rasterfoliegaten kan ^uitsluiten36 . Deze afhankelijkheid van de perfecte ijsdikte voor cryoEM met één deeltje heeft geleid tot een breed scala aan technieken en apparatuur die monsters kunnen bevriezen, waaronder ^{robotica37,38}, microfluïdica42 en ultrasone of spuitapparatuur27,39,40,41,42,43,44 . In de afgelopen jaren vertrouwen enkele van de meest populaire monstervoorbereidingsapparaten op het gebruik van robotica voor het automatisch invriezen van monsters met behulp van de blot-and-plunge-techniek45. Hoewel deze apparaten zijn ontworpen om reproduceerbaar de juiste ijsdikte te creëren voor beeldvorming, blijven ze vaak te duur voor individuele laboratoria om te kopen en te bedienen en worden ze over het algemeen gevonden in cryoEM-faciliteiten tegen uurtarieven voor gebruik. In de afgelopen jaren is de oorspronkelijke handmatige blot-and-plunge-techniek weer in gebruik gekomen3,47,48,49,50,51,52. Inderdaad, een handmatig bediende blot-and-plunge-apparaat kan cryoEM-roosters van hoge kwaliteit bereiken tegen een fractie van de kosten van robotachtige tegenhangers. Bovendien biedt handmatige blotting ook meer controle over blotting, omdat onderzoekers het type blotting (d.w.z. back-blotting van het raster, front-blotting van het raster, enz.) en blottingtijd kunnen aanpassen op basis van elke individuele steekproef en onderzoeksvragen.

In dit artikel geven we details over hoe biologische monsters effectief kunnen worden ingevroren met behulp van een traditioneel handmatig vlek-en-dompel vitrificatie-apparaat in combinatie met een op maat ontworpen dewar-platform53. Best practices, waaronder de voorbereiding van het cryogene, rasterbehandeling, monstertoepassing en blotting, evenals veelvoorkomende valkuilen en aanbevelingen over hoe deze hindernissen kunnen worden overwonnen, worden verstrekt. Advies over het verhogen van de reproduceerbaarheid van de ijsdikte tussen rasterpreparaten en het wijzigen van monstervlekken op basis van het biologische specimentype worden besproken. Gezien de lage kosten die gepaard gaan met de aankoop en bediening van de handmatige plunjer die in dit manuscript wordt beschreven, kunnen laboratoria over de hele wereld biologische monsters op een kosteneffectieve en reproduceerbare manier voorbereiden op cryoEM.