使用同质珠为基础的检测的查佩龙-科查佩龙相互作用研究

分子伴奏有助于蛋白质平衡，包括蛋白质折叠、运输和降解。它们调节几个细胞过程，与许多疾病有关，如癌症和神经退行性疾病^1。热休克蛋白90（Hsp90）是最重要的伴奏之一，其功能取决于ATP水解驱动的构象变化，并与由其共同伴奏²调解的客户蛋白结合。尽管Hsp90作为治疗靶点的潜力显而易见，但微调其功能是一个很大的挑战。有几个Hsp90抑制剂针对N终端ATP结合区，已在临床试验中评估，但没有一个已被批准营销^3。由于缺乏一个明确的配体绑定口袋^4，针对Hsp90的C终端区域已经取得了有限的成功^4。最近，小分子对Hsp90-cochaperone相互作用的破坏被作为替代策略⁵进行了研究。以Hsp90-cochaperone相互作用为目标不会引起一般细胞应激反应，并有可能具体调节各种细胞内过程。Hsp90 C 终点站保存的 MEEVD 五肽负责与共伴⁶的四肽重复 （TPR） 主题的相互作用。在人类蛋白质数据库中注释的736种TPR主题含图案的蛋白质中，有20种不同的蛋白质通过这种肽⁷与Hsp90相互作用。分子争夺MEEVD肽结合会破坏Hsp90和含有TPR域的共同伴奏之间的相互作用。肽结合场具有类似的第三级结构，但不同TPR主题域之间的整体同源性^{相对较低，提供了}一个机会来识别分子，特别是能够阻止Hsp90和特定TPR-主题共同伴奏之间的相互作用。在这些TPR-motif共同伴奏中，FK506结合蛋白（FKBP）51和FKBP52是类固醇激素受体（SHR）信号的调节器，并涉及多种类固醇激素依赖性疾病，包括癌症、压力相关疾病、代谢疾病和阿尔茨海默氏症^8。虽然FKBP51和FKBP52的份额>80%的序列相似性，但它们的功能不同：FKBP52是SHR活动的正调节器，而FKBP51在大多数情况下是负监管机构^。因此，识别分子，特别是阻断Hsp90和FKBP51或FKBP52之间的相互作用，为相关疾病提供了有希望的治疗潜力。

1994年，乌尔曼EF等人首次研制出一种Mpl化L微生P生源性Asay（阿尔法屏幕^）。现在，它被广泛用于检测不同类型的生物相互作用，如肽^10，蛋白质11，DNA12，RNA13和糖^14。在这项技术中，有两种珠子（直径200纳米），一种是捐赠珠，另一种是接受珠。生物分子固定在这些珠子上;他们的生物相互作用使捐赠者和接受者珠子接近。在680纳米处，捐赠珠中的光敏剂照亮并转换氧气为单氧。由于单氧寿命短，只能扩散至200纳米。如果接受珠在附近，其硫氧生成物与在370纳米下产生化疗的单氧发生反应。这种能量进一步激活荧光灯在同一接受珠发出光在520-620纳米^15。如果生物相互作用中断，接受珠和供体珠无法接近，导致单氧衰变和低生成信号。

在这里，我们描述了使用这种技术筛选小分子，抑制Hsp90和TPR共同伴奏之间的相互作用的协议，特别是FKBP51和FKBP52。与Hsp90极端C终点站对应的10种氨基酸长肽附着在接受珠上。纯化 Gst 标记的 Tpr 共同伴奏与谷胱甘肽相关的捐赠珠子相互作用。当Hsp90衍生肽和TPR-motif共同伴奏器之间的相互作用将珠子聚集在一起时，就会产生放大信号（图1A）。如果筛选的小分子可以抑制Hsp90和TPR-主题共同伴奏之间的相互作用，这个放大的信号将减少（图1B）。他们的IC₅₀ 可以通过定量测量来计算。此协议可以扩展到任何伴奏 – TPR-motif 共同伴奏相互作用的兴趣，并在新分子的发展中非常重要，特别是阻止Hsp90和FKBP51或FKBP52之间的相互作用。

图1：本检测的基本原则。（A） 纯化GST-FKBP51与谷胱甘肽相关的捐赠珠子相互作用。与Hsp90极端C终点相对应的10种氨基酸长肽附着在接受珠上。Hsp90 衍生肽和 FKBP51 的 TPR 域之间的相互作用使捐赠者和接受者珠子接近。在680纳米处，捐赠珠中的光敏剂照亮并转换氧气为单氧。接受珠上的硫化物衍生物与单氧发生反应，在 370 nm 处产生化疗。这种能量进一步激活同一接收珠中的荧光，以 520-620 nm 发射光。（B） 当小分子抑制Hsp90和FKBP51之间的相互作用时，供体和接受珠无法接近。然后，寿命短的单氧衰变，并且不产生可检测的信号。请单击此处查看此图的较大版本。