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Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Neurociencias

In vivo Avaliação da Dinâmica e Orientação em Caenorhabditis elegans Neurônios

Published: November 20, 2021
doi:
10.3791/62744
,
1DBT-National Brain Research Centre

Summary

Foi apresentado um protocolo para a imagem dos microtúbulos dinâmicos in vivo usando proteína de ligação final rotulada fluorescente. Descrevemos os métodos para rotular, imagem e analisar os microtúbulos dinâmicos no neurônio de microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.

Abstract

Nos neurônios, a orientação dos microtúbulos tem sido um dos principais assessores para identificar axônios que têm microtúbulos e dendritos que geralmente têm orientação mista. Aqui descrevemos métodos para rotular, imagem e analisar a dinâmica e crescimento de microtúbulos durante o desenvolvimento e regeneração de neurônios sensíveis ao toque em C. elegans. Usando repórteres fluorescentes geneticamente codificados de pontas de microtúbulos, nós imagemmos os microtúbulos axonais. As mudanças locais no comportamento dos microtúbulos que iniciam a regeneração do axônio após a axotomia podem ser quantificadas usando este protocolo. Este ensaio é adaptável a outros neurônios e origens genéticas para investigar a regulação da dinâmica dos microtúbulos em vários processos celulares.

Introduction

Os neurônios possuem uma arquitetura elaborada com compartimentos especializados como dendritos, corpos celulares, axônios e sinapses. O citoesqueleto neuronal é constituído dos microtúbulos, microfilamentos e neurofilamentos e sua organização distinta suporta os compartimentos neuronais estrutural e funcionalmente1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Ao longo dos anos, a organização dos microtúbulos foi identificada como um determinante chave da polaridade e função neuronal. À medida que os neurônios passam por remodelação estrutural durante o desenvolvimento ou regeneração, a dinâmica e orientação do microtúbulo determinam a identidade, o transporte polarizado, o crescimento e o desenvolvimento de vários compartimentos neuronais7. É, portanto, imperativo avaliar a dinâmica e orientação do microtúbulo in vivo para se correlacionar com o processo de remodelação neuronal.

Microtúbulos são compostos de perfis de α e β heterodimers tubulin com extremidades dinâmicas mais e extremidades relativamente estáveis menos11,12. A descoberta das proteínas de ligação final do complexo plus tip e associadas permitiu que uma plataforma avaliasse a organização dos microtúbulos13. As proteínas de ligação final (EBP) associam-se transitoriamente com as extremidades crescentes mais do microtúbulo e sua dinâmica de associação estão correlacionadas com o crescimento dos perfis de microtúbulos14,15. Devido à frequente associação e dissociação do complexo de pontas plus com o microtúbulo, a função de propagação de ponto do EBP marcado por GFP aparece como um “cometa” em um filme timelapse15,16. Desde a observação pioneira nos neurônios mamíferos16, proteínas de ligação final marcadas com proteínas fluorescentes têm sido utilizadas para determinar a dinâmica dos microtúbulos em diferentes sistemas modelo e tipos de neurônios17,18,19,20,21,22,23.

Devido ao seu simples sistema nervoso e corpo transparente, C. elegans provou ser um excelente sistema modelo para estudar a remodelagem neuronal durante o desenvolvimento e regeneração in vivo. Aqui descrevemos métodos para rotular, imagem e analisar a dinâmica e crescimento de microtúbulos durante o desenvolvimento e regeneração de neurônios sensíveis ao toque em C. elegans. Usando EBP-2::GFP geneticamente codificado, nós imagemmos os microtúbulos no neurônio PLM, o que nos permitiu determinar a polaridade dos microtúbulos em dois neurites diferentes deste neurônio24. Este método permite a observação e quantificação dos cometas EBP como medida da dinâmica dos microtúbulos em diferentes contextos celulares, por exemplo, as mudanças locais no comportamento dos microtúbulos que iniciam a regeneração do axônio após a axotomia podem ser avaliadas usando nosso protocolo. Este ensaio pode ser adaptado para investigar a regulação da dinâmica dos microtúbulos em diversos processos celulares em diversos tipos celulares e origens genéticas.

Protocol

1. Tensão repórter: Cultura e manutenção NOTA: Para medir a dinâmica e orientação do microtúbulo nos neurônios PLM, utilizou-se a cepa de verme expressando EBP-2::GFP sob o neurônio de toque promotor específico mec-4 (juIs338 alelo)18,25,26. Usamos a cultura padrão de vermes e métodos de manutenção para esta cepa<sup class="x…

Representative Results

Como exemplo representativo, descrevemos a observação in vivo dos cometas EBP nos axônios de estado estável e regeneradores dos neurônios PLM. Os neurônios PLM estão localizados na região da cauda do verme com um longo processo anterior que forma uma sinapse e um processo posterior curto. Os neurônios PLM crescem na direção anterior-posterior perto da epiderme e são responsáveis pela sensação de toque suave nos vermes. Devido à sua estrutura simplificada, e à comodidade à imagem e à microcirurgia, os n…

Discussion

A compreensão da dinâmica dos microtúbulos tem sido um foco fundamental no campo da pesquisa citoesquelletal ao longo dos anos. Microtúbulos sofrem nucleação e catástrofe, juntamente com um processo contínuo de instabilidade dinâmica44,45,46,47. Grande parte dessas informações foi obtida através de ensaios in vitro, como leituras de dispersão de luz de …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Yishi Jin e Andrew Chisholm pelo apoio inicial e pela tensão usada no estudo. A cepa bacteriana OP50 foi comercializada do Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC) financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Agradecemos também a Dharmendra Puri pela padronização dos procedimentos experimentais. O estudo é financiado pela bolsa central do Centro Nacional de Pesquisa Cerebral (apoiado pelo Departamento de Biotecnologia, Govt. of India), DBT/Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA/E/18/1/504331) para S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA/I/13/1/500874) para A.G.-R e uma bolsa do Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (SERB: CRG/2019/002194) para A.G.-R.

Materials

CZ18975 worm strain Yishi Jin lab CZ18975 Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose Sigma A9539 Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm) Zeiss 474030-9010-000 Mounting worms
Dry bath with heating block Neolab Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm) Blue Star Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) Polysciences Inc. 00876 Mounting worms
Test tubes Mounting worms
OP50 bacterial strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Worm handling
60mm petri plates Praveen Scientific 20440 Worm handling
Aspirator/Capillary VWR 53432-921 Worm handling
Incubator Panasonic MIR554E Worm handling
Platinum wire Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment Leica M165FC Worm handling
0.3% Sodium Chloride Sigma 71376 Nematode Growth Medium
0.25% Peptone T M Media 1506 Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol Sigma C8667 Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate Sigma 223506 Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate Sigma M2773 Nematode Growth Medium
2% Agar T M Media 1202 Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride Sigma 71376 1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride Fisher Scientific 21405 1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate Sigma S9390 1X M9 buffer
Glass bottles Borosil Buffer storage
488 nm laser Zeiss Imaging
5X objective Zeiss Imaging
63X objective Zeiss Imaging
Camera Photometrics Evolve 512 Delta Imaging
Computer system for Spinning Disk unit HP Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz Imaging
Epifluorescence microscope Zeiss Observer.Z1 Imaging
Halogen lamp Zeiss Imaging
Mercury Arc Lamp Zeiss Imaging
Spinning Disk Unit Yokogawa CSU-X1 Imaging
ZEN2 software Zeiss Imaging
Image J (Fiji Version) Image analysis and processing
Adobe Creative Cloud Adobe Image analysis and processing
Computer system for Image Analysis Dell Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz Image processing/Representation
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Dey, S., Ghosh-Roy, A. In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons. J. Vis. Exp. (177), e62744, doi:10.3791/62744 (2021).
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