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Abstract
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Neurociencias

インビボカエノハブディティス・エレガンスニューロンにおける微小管動態と向きの評価

Published: November 20, 2021
doi:
10.3791/62744
,
1DBT-National Brain Research Centre

Summary

蛍光標識End結合タンパク質を用いて 生体内で 動的微小管をイメージングするプロトコルが提示された。 我々は、C.エレガンスの後方微小管(PLM)ニューロンにおける動的微小管の標識、画像化、および分析の方法を説明した。

Abstract

ニューロンでは、微小管配向は、一般的に配向が混在するプラスエンドアウト微小管と樹状突起を有する軸索を同定するための重要な査定者であった。ここでは 、C.エレガンス におけるタッチニューロンの発達と再生中の微小管ダイナミクスおよび成長を標識、画像化、分析する方法について説明する。微小管先端の遺伝的にコードされた蛍光レポーターを用いて、軸索微小管を画像化した。このプロトコルを使用して、奇数に続いて軸索再生を開始する微小管挙動の局所的変化を定量化することができる。このアッセイは、様々な細胞プロセスにおける微小管ダイナミクスの調節を調査するために、他のニューロンおよび遺伝的背景に適応可能である。

Introduction

ニューロンは、樹状突起、細胞体、軸索、シナプスなどの特殊なコンパートメントを備えた精巧なアーキテクチャを持っています。ニューロン細胞骨格は、微小管、マイクロフィラメント、および神経フィラメントと、その明確な組織が、神経区画を構造的および機能的に支持する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 .長年にわたり、微小管組織は、神経極性および機能の重要な決定要因として同定されてきた。ニューロンが開発中または再生中に構造リモデリングを受けるにつれて、微小管のダイナミクスと配向は、様々なニューロンコンパートメントのアイデンティティ、偏光輸送、成長、および発達を決定する。したがって、ニューロンリモデリングプロセスと相関させるために、生体内での微小管ダイナミクスおよび向きを評価することが不可欠である。

微小管は、αおよびβのtubulinヘテロ二量体の原始フィラメントで構成され、動的なプラスエンドと比較的安定したマイナス末端11,12を有する。プラス先端複合体および関連するエンド結合タンパク質の発見により、プラットフォームは微小管組織13を評価することができました。エンド結合タンパク質(EBP)は、微小管の成長プラス末端と一過性に関連付け、それらの関連ダイナミクスは、微小管原線維14、15の成長と相関している。微小管とのプラス先端複合体の頻繁な関連付けと解離のために、GFPタグ付きEBPの点広がり関数は、タイムラプスムービー15,16において「彗星」として現れる。哺乳類ニューロン16における先駆的な観察以来、蛍光タンパク質でタグ付けされた末端結合タンパク質は、異なるモデル系およびニューロンタイプ17、18、19、20、21、22、23の間で微小管ダイナミクスを決定するために使用されてきた。

その単純な神経系と透明な体のために 、C.エレガンス は 、開発中および生体内の再生中にニューロンのリモデリングを研究するための優れたモデルシステムであることが証明されています。ここでは 、C.エレガンス におけるタッチニューロンの発達と再生中の微小管ダイナミクスおよび成長を標識、画像化、分析する方法について説明する。遺伝的にコード化されたEBP-2:::GFPを用いて、PLMニューロン内の微小管を画像化し、このニューロン24の2つの異なる神経突起中の微小管の極性を決定することができた。この方法は、異なる細胞コンテキストにおける微小管ダイナミクスの尺度としてEBP彗星の観察および定量化を可能にする、例えば、奇方解術後に軸索再生を開始する微小管挙動の局所的変化は、我々のプロトコルを用いて評価することができる。このアッセイは、多様な細胞タイプおよび遺伝的背景における様々な細胞プロセスにおける微小管動力学の調節を調べることができる。

Protocol

1. レポーター株:文化とメンテナンス 注:PLMニューロンの微小管のダイナミクスと向きを測定するために、我々はEBP-2を発現するワーム株を使用しました::GFPはタッチニューロン特異的プロモーター mec-4(juIs338アレーレ)18、25、26の下で。私たちは、この株<sup …

Representative Results

代表的な例として、PLMニューロンの定常状態および再生軸索におけるEBP彗星のインビボ観察について説明した。PLMニューロンは、シナプスと短い後工程を形成する長い前工程を有するワームの尾領域に位置する。PLMニューロンは表皮に近い前部後方向に成長し、ワームの穏やかな接触感覚を担う。PLMニューロンは、その構造が単純化され、イメージングとマイクロサージャリーに対する無分?…

Discussion

微小管ダイナミクスを理解することは、長年にわたって細胞骨格研究の分野で重要な焦点となっています。微小管は、動的不安定性44、45、46、47の連続的なプロセスと共に核形成および大惨事を起こす。この情報の多くは、遊離対重合チューブリンの光散乱読み出し、蛍光チ…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、初期のサポートと研究で使用される緊張のためにイーシ・ジンとアンドリュー・チザムに感謝します。細菌株OP50は、研究インフラプログラムのNIH事務所(P40 OD010440)が資金を提供するカエノハブディティス遺伝学センター(CGC)から商業的に利用されました。また、実験手順の標準化に対するダルメンドラ・プリに感謝します。この研究は、国立脳研究センター(インドのバイオテクノロジー省、インド政府の支援)、DBT/ウェルカム・トラスト・インディア・アライアンス早期キャリア・グラント(グラント#IA/E/18/1/504331)のS.D.、ウェルカム・トラストDBTインド同盟中間助成金(グラント#IA/I/13/1/500874)のコアグラントによって資金提供されています。 CRG/2019/002194) から A.G.-R へ。

Materials

CZ18975 worm strain Yishi Jin lab CZ18975 Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose Sigma A9539 Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm) Zeiss 474030-9010-000 Mounting worms
Dry bath with heating block Neolab Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm) Blue Star Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) Polysciences Inc. 00876 Mounting worms
Test tubes Mounting worms
OP50 bacterial strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Worm handling
60mm petri plates Praveen Scientific 20440 Worm handling
Aspirator/Capillary VWR 53432-921 Worm handling
Incubator Panasonic MIR554E Worm handling
Platinum wire Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment Leica M165FC Worm handling
0.3% Sodium Chloride Sigma 71376 Nematode Growth Medium
0.25% Peptone T M Media 1506 Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol Sigma C8667 Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate Sigma 223506 Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate Sigma M2773 Nematode Growth Medium
2% Agar T M Media 1202 Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride Sigma 71376 1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride Fisher Scientific 21405 1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate Sigma S9390 1X M9 buffer
Glass bottles Borosil Buffer storage
488 nm laser Zeiss Imaging
5X objective Zeiss Imaging
63X objective Zeiss Imaging
Camera Photometrics Evolve 512 Delta Imaging
Computer system for Spinning Disk unit HP Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz Imaging
Epifluorescence microscope Zeiss Observer.Z1 Imaging
Halogen lamp Zeiss Imaging
Mercury Arc Lamp Zeiss Imaging
Spinning Disk Unit Yokogawa CSU-X1 Imaging
ZEN2 software Zeiss Imaging
Image J (Fiji Version) Image analysis and processing
Adobe Creative Cloud Adobe Image analysis and processing
Computer system for Image Analysis Dell Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz Image processing/Representation
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Dey, S., Ghosh-Roy, A. In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons. J. Vis. Exp. (177), e62744, doi:10.3791/62744 (2021).
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