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Abstract
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Neurociencias

Im lebenden Organismus Beurteilung der Dynamik und Orientierung von Mikrotubuli in Caenorhabditis elegans Neuronen

Published: November 20, 2021
doi:
10.3791/62744
,
1DBT-National Brain Research Centre

Summary

Ein Protokoll zur Abbildung der dynamischen Mikrotubuli in vivo unter Verwendung fluoreszierend markierten Endbindungsproteins wurde vorgestellt. Wir beschrieben die Methoden zur Markierung, Abbildung und Analyse der dynamischen Mikrotubuli im neuron posterioren lateralen Mikrotubuli (PLM) von C. elegans.

Abstract

In Neuronen war die Mikrotubuliorientierung ein Schlüsselbewerter, um Axone zu identifizieren, die Plus-End-Out-Mikrotubuli und Dendriten haben, die im Allgemeinen eine gemischte Orientierung haben. Hier beschreiben wir Methoden zur Markierung, Abbildung und Analyse der Mikrotubulidynamik und des Wachstums während der Entwicklung und Regeneration von Berührungsneuronen in C. elegans. Mit genetisch kodierten fluoreszierenden Reportern von Mikrotubuli-Spitzen haben wir die axonalen Mikrotubuli abgebildet. Die lokalen Veränderungen im Mikrotubuli-Verhalten, die die Axonregeneration nach axonerektomie initiieren, können mit diesem Protokoll quantifiziert werden. Dieser Assay ist an andere Neuronen und genetische Hintergründe anpassbar, um die Regulation der Mikrotubuli-Dynamik in verschiedenen zellulären Prozessen zu untersuchen.

Introduction

Neuronen haben eine ausgeklügelte Architektur mit spezialisierten Kompartimenten wie Dendriten, Zellkörpern, Axonen und Synapsen. Das neuronale Zytoskelett besteht aus den Mikrotubuli, Mikrofilamenten und Neurofilamenten und ihre unterschiedliche Organisation unterstützt die neuronalen Kompartimente strukturell und funktionell1,2,3,4, 5,6,7,8,9,10 . Im Laufe der Jahre wurde die Organisation von Mikrotubuli als Schlüsseldeterminante für neuronale Polarität und Funktion identifiziert. Da Neuronen während der Entwicklung oder Regeneration einem strukturellen Umbau unterzogen werden, bestimmen die Dynamik und Orientierung der Mikrotubuli die Identität, den polarisierten Transport, das Wachstum und die Entwicklung verschiedener neuronaler Kompartimente7. Es ist daher unerlässlich, die Dynamik und Orientierung der Mikrotubuli in vivo zu bewerten, um mit dem neuronalen Umbauprozess zu korrelieren.

Mikrotubuli bestehen aus Protofilamenten α und β Tubulin-Heterodimeren mit dynamischen Plusenden und relativ stabilen Minusenden11,12. Die Entdeckung des Plus-Tip-Komplexes und der damit verbundenen Endbindungsproteine haben es einer Plattform ermöglicht, die Mikrotubuli-Organisation zu bewerten13. Endbindungsproteine (EBP) assoziieren sich vorübergehend mit den wachsenden Plusenden der Mikrotubuli und ihre Assoziationsdynamik korreliert mit dem Wachstum der Mikrotubuli-Protofilamente14,15. Aufgrund der häufigen Assoziation und Dissoziation von Plusspitzenkomplex mit dem Mikrotubuli erscheint die Punktspreizfunktion von GFP-getaggtem EBP als “Komet” in einem Zeitrafferfilm15,16. Seit der bahnbrechenden Beobachtung in Säugetierneuronen16werden Endbindungsproteine, die mit fluoreszierenden Proteinen markiert sind, verwendet, um die Mikrotubulidynamik über verschiedene Modellsysteme und Neuronentypen17,18,19,20,21,22,23zu bestimmen.

Aufgrund seines einfachen Nervensystems und seines transparenten Körpers hat sich C. elegans als hervorragendes Modellsystem erwiesen, um den neuronalen Umbau während der Entwicklung und Regeneration in vivo zu untersuchen. Hier beschreiben wir Methoden zur Markierung, Abbildung und Analyse der Mikrotubulidynamik und des Wachstums während der Entwicklung und Regeneration von Berührungsneuronen in C. elegans. Mit genetisch kodiertem EBP-2::GFP haben wir die Mikrotubuli im PLM-Neuron abgebildet, wodurch wir die Polarität der Mikrotubuli in zwei verschiedenen Neuriten dieses Neurons24bestimmen konnten. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung und Quantifizierung der EBP-Kometen als Maß für die Mikrotubuli-Dynamik in verschiedenen zellulären Kontexten, zum Beispiel können die lokalen Veränderungen im Mikrotubuli-Verhalten, die die Axonregeneration nach axonischer Axotomie initiieren, mit unserem Protokoll beurteilt werden. Dieser Assay kann angepasst werden, um die Regulation der Mikrotubuli-Dynamik in verschiedenen zellulären Prozessen in verschiedenen Zelltypen und genetischen Hintergründen zu untersuchen.

Protocol

1. Reporter-Sorte: Kultur und Pflege HINWEIS: Um die Dynamik und Orientierung der Mikrotubuli in den PLM-Neuronen zu messen, verwendeten wir den Wurmstamm, der EBP-2::GFP unter dem Berührungsneuron-spezifischen Promotor mec-4 (juIs338-Allel) 18,25,26exprimiert. Für diesen Stamm verwenden wir Standard-Wurmkultur- und Wartungsmethoden<sup c…

Representative Results

Als repräsentatives Beispiel haben wir die in vivo Beobachtung der EBP-Kometen in den stationären und regenerierenden Axonen der PLM-Neuronen beschrieben. PLM-Neuronen befinden sich im Schwanzbereich des Wurms mit einem langen vorderen Prozess, der eine Synapse und einen kurzen hinteren Prozess bildet. PLM-Neuronen wachsen in vorderer und hinterer Richtung nahe der Epidermis und sind für das sanfte Berührungsgefühl bei den Würmern verantwortlich. Aufgrund ihrer vereinfachten Struktur und ihrer Zugänglichkeit für …

Discussion

Das Verständnis der Mikrotubuli-Dynamik war im Laufe der Jahre ein Schwerpunkt auf dem Gebiet der Zytoskelettforschung. Mikrotubuli durchlaufen Keimbildung und Katastrophe zusammen mit einem kontinuierlichen Prozess dynamischer Instabilität44,45,46,47. Viele dieser Informationen wurden durch In-vitro-Assays wie Lichtstreuanzeigen von freiem vs. polymerisiertem Tub…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Yishi Jin und Andrew Chisholm für die anfängliche Unterstützung und die in der Studie verwendete Sorte. Der Bakterienstamm OP50 wurde kommerziell vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) in Anspruch genommen, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wurde. Wir danken auch Dharmendra Puri für die Standardisierung der experimentellen Verfahren. Die Studie wird durch den Kernzuschuss des National Brain Research Centre (unterstützt vom Department of Biotechnology, Govt. of India), DBT / Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA / E / 18 / 1 / 504331) an S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA / I / 13 / 1 / 1 / 500874) an A.G.-R und einen Zuschuss des Science and Engineering Research Board (SERB: CRG/2019/002194) an A.G.-R.

Materials

CZ18975 worm strain Yishi Jin lab CZ18975 Generated by Anindya Ghosh-Roy
Agarose Sigma A9539 Mounting worms
Coverslip (18 mm x 18 mm) Zeiss 474030-9010-000 Mounting worms
Dry bath with heating block Neolab Mounting worms
Glass slides (35 mm x 25 mm) Blue Star Mounting worms
Polystyrene bead solution (4.55 x 10^13 particles/ml in aqueous medium with minimal surfactant) Polysciences Inc. 00876 Mounting worms
Test tubes Mounting worms
OP50 bacterial strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Worm handling
60mm petri plates Praveen Scientific 20440 Worm handling
Aspirator/Capillary VWR 53432-921 Worm handling
Incubator Panasonic MIR554E Worm handling
Platinum wire Worm handling
Stereomicroscope with fluorescence attachment Leica M165FC Worm handling
0.3% Sodium Chloride Sigma 71376 Nematode Growth Medium
0.25% Peptone T M Media 1506 Nematode Growth Medium
10mg/mL Cholesterol Sigma C8667 Nematode Growth Medium
1mM Calcium chloride dihydrate Sigma 223506 Nematode Growth Medium
1mM Magnesium sulphate heptahydrate Sigma M2773 Nematode Growth Medium
2% Agar T M Media 1202 Nematode Growth Medium
25mM Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 Nematode Growth Medium
0.1M Monobasic Potassium dihydrogen phosphate Sigma P9791 1X M9 buffer
0.04M Sodium chloride Sigma 71376 1X M9 buffer
0.1M Ammonium chloride Fisher Scientific 21405 1X M9 buffer
0.2M Dibasic Disodium hydrogen phosphate heptahydrate Sigma S9390 1X M9 buffer
Glass bottles Borosil Buffer storage
488 nm laser Zeiss Imaging
5X objective Zeiss Imaging
63X objective Zeiss Imaging
Camera Photometrics Evolve 512 Delta Imaging
Computer system for Spinning Disk unit HP Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz Imaging
Epifluorescence microscope Zeiss Observer.Z1 Imaging
Halogen lamp Zeiss Imaging
Mercury Arc Lamp Zeiss Imaging
Spinning Disk Unit Yokogawa CSU-X1 Imaging
ZEN2 software Zeiss Imaging
Image J (Fiji Version) Image analysis and processing
Adobe Creative Cloud Adobe Image analysis and processing
Computer system for Image Analysis Dell Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz Image processing/Representation
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Referencias

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Dey, S., Ghosh-Roy, A. In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons. J. Vis. Exp. (177), e62744, doi:10.3791/62744 (2021).
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