Etablierung einer elektrophysiologischen Plattform zur Modellierung von ALS mit regionalspezifischen humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Astrozyten und Neuronen
Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Differenzierung von vom Menschen induzierten pluripotenten Astrozyten und Neuronen des Rückenmarks und deren Kokultur für die elektrophysiologische Aufzeichnung.
Abstract
Aus humanen pluripotenten Stammzellen gewonnene Astrozyten (hiPSC-A) und Neuronen (hiPSC-N) bieten ein leistungsfähiges Werkzeug für die Modellierung der Pathophysiologie der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS) in vitro. Multi-Elektroden-Array-Aufzeichnungen (MEA) sind ein Mittel, um elektrische Feldpotentiale von großen Populationen von Neuronen aufzuzeichnen und die Netzwerkaktivität im Laufe der Zeit zu analysieren. Es wurde bereits gezeigt, dass das Vorhandensein von hiPSC-A, das unter Verwendung von Techniken zur Förderung eines Rückenmarks-Astrozyten-Phänotyps differenziert wird, die Reifung und elektrophysiologische Aktivität von regional spezifischen spinalspezifischen hiPSC-Motoneuronen (MN) des Rückenmarks im Vergleich zu denen verbessert, die ohne hiPSC-A oder in Gegenwart von Nagetier-Astrozyten kultiviert wurden. Hier wird ein Verfahren beschrieben, um das Rückenmark hiPSC-A mit hiPSC-MN zu kokulturieren und die elektrophysiologische Aktivität mittels MEA-Aufzeichnungen aufzuzeichnen. Während die hier beschriebenen Differenzierungsprotokolle spezifisch für Astrozyten und Neuronen sind, die regional spezifisch für das Rückenmark sind, kann die Co-Cultureing-Plattform auf Astrozyten und Neuronen angewendet werden, die mit Techniken differenziert werden, die für andere Schicksale spezifisch sind, einschließlich kortikaler hiPSC-A und hiPSC-N. Diese Protokolle zielen darauf ab, einen elektrophysiologischen Assay bereitzustellen, um über Glia-Neuronen-Interaktionen zu informieren und eine Plattform für die Erprobung von Medikamenten mit therapeutischem Potenzial bei ALS zu bieten.
Introduction
Aus humanen pluripotenten Stammzellen gewonnene Astrozyten (hiPSC-A) und Neuronen (hiPSC-N) sind leistungsfähige Werkzeuge für die Modellierung der Pathophysiologie der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS) in vitro und bieten ein translationales Paradigma für Strategien zur Arzneimittelforschung1. Forscher haben gezeigt, dass die Co-Kultur von hiPSC-A mit hiPSC-N die morphologische, molekulare, elektrophysiologische und pharmakologische Reifung beider Zelltypen verbessert und komplexe neuronale Netzwerke und Astrozyten-Neuronen-Interaktionen erzeugt, die ihren In-vivo-Gegenstücken ähneln 2,3. Ähnliche Co-Kultur-Experimente können Kennzeichen der ALS-Pathobiologie wie Astrozyten-vermittelte Neurotoxizität 4,5 und neuronale Hypererregbarkeit6 rekapitulieren. Darüber hinaus können humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSC) mit Fortschritten bei den Differenzierungsprotokollen in regionalspezifische neuronale Subtypen differenziert werden, einschließlich kortikaler und Rückenmarks-hiPSC-A und hiPSC-N 7,8. Diese Strategien bieten das Potenzial für die Modellierung der kortikalen und spinalen Motoneuron-Pathologie bei ALS sowie des astrozytären Einflusses auf beide. Dies setzt jedoch voraus, dass es einen reproduzierbaren funktionellen Assay gibt, um diese Effekte zu bestimmen.
Kürzlich wurde gezeigt, dass die Multi-Elektroden-Array-Aufzeichnung (MEA) besonders geeignet für die elektrophysiologische Charakterisierung von Neuron-Astrozyten-Cokulturenist 2. Im Gegensatz zu elektrophysiologischen Einzelzellanalysen zeichnen diese hochdichten Elektrodenarrays passiv extrazelluläre Feldpotentiale von großen Neuronenpopulationen auf, ohne die Kulturbedingungen zu stören und die Integrität der Zellmembranen zu erhalten. Diese Plattformen sind besonders nützlich, um die Zell- und Netzwerkaktivität von Kulturen im Laufe der Zeit und als Reaktion auf pharmakologische Manipulationen aufzuzeichnen. Schließlich, wenn das Vorhandensein von Astrozyten eine Kulturvariable ist, können MEA-Aufzeichnungen funktionelle Einblicke in bidirektionale Interaktionen zwischen Astrozyten und Neuronen liefern 2,9.
Hier wird ein optimiertes Protokoll für die Differenzierung von hiPSC in Rückenmark-hiPSC-A und hiPSC-Motoneuronen (MN) vorgestellt, das zuvor validiert wurde2. Das hiPSC-A-Differenzierungsprotokoll des Rückenmarks führt durchweg zu Astrozytenkulturen, die in bis zu 80%, 50% bzw. 90% der Zellen positiv für S100-Calcium-bindendes Protein B (S100β), Gliafibrillen-saures Protein (GFAP) und Homöobox B4 (HOXB4) sind, was auf eine reifende Glia- und Rückenmarksspezifikation hinweist 2,10 . Das hiPSC-MN-Differenzierungsprotokoll erzeugt Neuronen, die zu >90% positiv für Cholin-Acetyltransferase (ChAT) sind, was auf eine reife alpha-motorische Neuronenidentitäthindeutet 2. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll Techniken zur Erzeugung von hiPSC-A/MN-Cokulturen, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie im Vergleich zu neuronalen Kulturen ohne Astrozyten oder mit Nagetier-Astrozytenzu Neuronen mit erhöhter morphologischer Komplexität führen. Während diese Beschreibungen spezifisch für das Rückenmark hiPSC-A und hiPSC-N sind, besteht ein einzigartiger Vorteil darin, dass die anfängliche unabhängige Kultur von Astrozyten und Neuronen, gefolgt von Schritten zur Kokultur zu späteren Zeitpunkten, übersetzt werden kann, um die Auswirkungen von Neuron-Astrozyten-Interaktionen aus anderen spezifischen Regionen sowie krankheitsspezifischen Zellen zu untersuchen 7,8 . Schließlich beschreibt das Protokoll, wie diese Kulturen auf MEA-Platten gezüchtet werden können, so dass die funktionelle Aktivität als Faktor der Kokulturzusammensetzung im Laufe der Zeit untersucht werden kann, mit der Fähigkeit, die zelluläre Zusammensetzung sowie die Kulturbedingungen zu manipulieren.
Das Ziel dieser Protokolle ist es, einen funktionellen Assay zur Verfügung zu stellen, um Astrozyten-Neuronen-Interaktionen zu untersuchen, krankheitsspezifische Veränderungen zu untersuchen und Medikamente mit therapeutischem Potenzial im Bereich ALS zu testen. Für die anspruchsvollsten Schritte dieses Protokolls werden Videoanweisungen bereitgestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bisher haben hiPSC- und MEA-basierte Methoden zur elektrophysiologischen Aufzeichnung von Astrozyten-Neuronen-Kokulturen im Bereich der ALS6 nur begrenzte Anwendung gefunden und sind im Gegensatz zu ihrer weiter verbreiteten Verwendung für die In-vitro-Modellierung von Epilepsie9 noch nicht vollständig auf humanen Plattformen anwendbar. Diese Plattform hat jedoch das Potenzial, pathophysiologisch relevante Fragen in der ALS-Forschung zu beantworten, wie z.B. die …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Manuskript wurde durch Folgendes unterstützt: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Career Development Award (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Wir danken Dr. Raha Dastgheyb und Dr. Norman Haughey für die Bereitstellung der MEA-Plattform und der Datenanalysesoftware, die wir zur Validierung der beschriebenen elektrophysiologischen Plattform verwendet haben. Wir bedanken uns bei Khalil Rust für die Unterstützung bei der Protokollvorführung und beim Filmen.
Materials
| 10 cm sterile culture plates | Falcon | 353003 | |
| 25 cm2 sterile culture flasks | Falcon | 353136 | |
| 2-Mercaptoethanol (β-ME) | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 110 µM |
| 500 mL 0.2 µm CA Filter System | Corning | 430769 | |
| 5 mL pipette | Falcon | 357543 | |
| 6 well sterile culture plates | Falcon | 3046 | |
| Amphotericine B | Gibco | 15290018 | Working concentration 2.0 μg/mL |
| Anionic detergent with protease enzyme – Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Working concentration 1% m/v |
| Ascorbic acid (ASAC) | Sigma | A4403 | Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL). |
| Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) | Axion | OPT-24 | |
| Axion Edge MEA platform | Axion | Maestro Edge | |
| Basement Membrane matrix – Matrigel | Corning | 354277 | Details in the protocol |
| Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) | Zeiss | 415510-1100-000 | Primo Vert |
| Bicuculline | Sigma Aldrich | 14340 | Working concentration10 μM |
| Ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| CO2 tanks and regulator for Axion Edge | AirGas/Harris | 9296NC | |
| Compound E | Abcam | ab142164 | Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM). |
| Cyanquixaline (CNQX) | Sigma Aldrich | C239 | Working concentration 50 μM |
| Dihydrokainic acid (DHK) | Tocris | 111 | Working concentration 50 μM and 300 μM |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 113300 | Working concentration 1x |
| Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement | Thermofisher | A1517001 | Combine 10 mL of Essential 8 (10x) supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermofisher | 16140071 | Working concentration 1x |
| Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Hemocytometer | Election Microscopy Sciences | 63510-20 | |
| Heparin | Millipore-sigma | H3149-100KU | Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL). |
| Humidity controlled Cell culture incubator | ThermoFisher | 370 | set to 37 ºC, 5 % CO2 |
| Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R&D systems | 291-G1-200 | Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Kainc acid | Abcam | ab144490 | Working concentration 5 μM |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10828 | Working concentration 1x |
| Laminin | Thermofisher | 23017-015 | Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media) |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution |
| L-Glutamine | Thermofisher | 25030 | Working concentration 100x |
| MEA glass plates | MultiChannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti-gr | |
| Multichannel Pipet P200 | Gilson | PJ22224 | |
| Neurobasal | Thermofisher | 21103049 | Working concentration 1x |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermofisher | 11140050 | Working concentration 100x |
| Pencillin/Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | Working concentration 100x |
| Polyornithine (PLO) | Sigma-Aldrich | P3655 | Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL) |
| Potassium chloride (KCl) | NA | NA | Working concentration100 mM |
| Purmorphamine (PMN) | Millipore-Sigma | 540223 | Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM). |
| Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM). |
| ROCK-I nhibitor | Peprotech | 1293823 | Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM). |
| SB431542 | Sigma | S4317 | Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM) |
| Sterile cell culture hoods | Baker Company | SG-600 | |
| Supplement B – B27 Supplement | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 50x |
| Supplement N – N2 Supplement | Thermofisher | 17502048 | Working concentration 100x |
| Table top cell culture centrifuge | ThermoFisher | 75004261 | Sorvall Legend X1R |
| Thermoplastic film – Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
| Tissue dissociation protease – Dispase | StemCell Technologies | 7923 | Working concentration 1x |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL). |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher | 2530054 | Working concentration 1x |
| Waterbath | ThermoFisher | 2332 | Isotemp |
Referencias
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