Establecimiento de una plataforma electrofisiológica para modelar la ELA con astrocitos y neuronas derivados de células madre pluripotentes humanas específicas de la región
Summary
Describimos un método para diferenciar astrocitos y neuronas derivados pluripotentes inducidos por humanos de la médula espinal y su cocultivo para el registro electrofisiológico.
Abstract
Los astrocitos y neuronas derivados de células madre pluripotentes humanas (hiPSC-A) y las neuronas (hiPSC-N) proporcionan una herramienta poderosa para modelar la fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) in vitro. Las grabaciones de matriz de electrodos múltiples (MEA) son un medio para registrar potenciales de campo eléctrico de grandes poblaciones de neuronas y analizar la actividad de la red a lo largo del tiempo. Se demostró previamente que la presencia de hiPSC-A que se diferencian utilizando técnicas para promover un fenotipo de astrocito de la médula espinal mejoró la maduración y la actividad electrofisiológica de las neuronas motoras (MN) hiPSC de la médula espinal específicas regionalmente en comparación con las cultivadas sin hiPSC-A o en presencia de astrocitos de roedores. Aquí se describe un método para cocultivar hiPSC-A de la médula espinal con hiPSC-MN y registrar la actividad electrofisiológica utilizando grabaciones MEA. Si bien los protocolos de diferenciación descritos aquí son particulares para los astrocitos y las neuronas que son regionalmente específicos de la médula espinal, la plataforma de cocultivo se puede aplicar a astrocitos y neuronas diferenciadas con técnicas específicas para otros destinos, incluidos hiPSC-A cortical e hiPSC-N. Estos protocolos tienen como objetivo proporcionar un ensayo electrofisiológico para informar sobre las interacciones glia-neurona y proporcionar una plataforma para probar medicamentos con potencial terapéutico en la ELA.
Introduction
Los astrocitos y neuronas derivados de células madre pluripotentes humanas (hiPSC-A) y las neuronas (hiPSC-N) son herramientas poderosas para modelar la fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) in vitro y proporcionan un paradigma traslacional para las estrategias de descubrimiento de fármacos1. Los investigadores han demostrado que el cocultivo de hiPSC-A con hiPSC-N mejora la maduración morfológica, molecular, electrofisiológica y farmacológica de ambos tipos celulares, generando redes neuronales complejas e interacciones astrocito-neurona que se asemejan a sus contrapartes in vivo 2,3. Experimentos similares de cocultivo pueden recapitular las características distintivas de la patobiología de la ELA, como la neurotoxicidad mediada por astrocitos 4,5 y la hiperexcitabilidad neuronal6. Además, con los avances en los protocolos de diferenciación, las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) se pueden diferenciar en subtipos neuronales específicos de la región, incluidos hiPSC-A cortical y de médula espinal e hiPSC-N 7,8. Estas estrategias proporcionan el potencial para modelar la patología de las neuronas motoras corticales y espinales en la ELA, así como la influencia astrocítica en ambas. Sin embargo, esto requiere que haya un ensayo funcional reproducible para determinar estos efectos.
Recientemente se demostró que el registro de matriz de electrodos múltiples (MEA) es particularmente adecuado para la caracterización electrofisiológica de cocultivos neuronales-astrocitos2. A diferencia de los análisis electrofisiológicos unicelulares, estas matrices de electrodos de alta densidad registran pasivamente los potenciales de campo extracelular de grandes poblaciones de neuronas sin interrumpir las condiciones de cultivo y preservar la integridad de las membranas celulares. Estas plataformas son particularmente útiles para registrar la actividad celular y de red de los cultivos a lo largo del tiempo y en respuesta a la manipulación farmacológica. Finalmente, cuando la presencia de astrocitos es una variable de cultivo, los registros de MEA pueden proporcionar información funcional sobre las interacciones bidireccionales astrocito-neurona 2,9.
Aquí se presenta un protocolo optimizado para la diferenciación de hiPSC en hiPSC-A de la médula espinal y hiPSC-neuronas motoras (MN) que ha sido previamente validado2. El protocolo de diferenciación hiPSC-A de la médula espinal da como resultado consistentemente cultivos de astrocitos, que son positivos para la proteína B de unión al calcio S100 (S100β), la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y Homeobox B4 (HOXB4) en hasta el 80%, 50% y 90% de las células, respectivamente, lo que indica una especificación glial y de la médula espinal madura 2,10 . El protocolo de diferenciación hiPSC-MN genera neuronas que son >90% positivas para la colina acetiltransferasa (ChAT), lo que sugiere una identidad madura de neurona alfa-motora2. Además, el protocolo describe técnicas para la generación de cocultivos hiPSC-A/MN previamente demostrados para dar lugar a neuronas con mayor complejidad morfológica por análisis de Scholl y microscopía inmunofluorescente en comparación con cultivos neuronales sin astrocitos o con astrocitos de roedores2. Si bien estas descripciones son específicas de la médula espinal hiPSC-A y hiPSC-N, una ventaja única es que el cultivo independiente inicial de astrocitos y neuronas seguido de pasos para el cocultivo en puntos de tiempo posteriores se puede traducir para estudiar los efectos de las interacciones neurona-astrocito de otras regiones específicas, así como de células específicas de la enfermedad 7,8 . Finalmente, el protocolo describe cómo cultivar estos cultivos en placas MEA para que la actividad funcional como factor de composición de cocultivo pueda estudiarse a lo largo del tiempo con la capacidad de manipular la composición celular y las condiciones de cultivo.
El objetivo de estos protocolos es proporcionar un ensayo funcional para investigar las interacciones astrocito-neurona, examinar los cambios específicos de la enfermedad y probar medicamentos con potencial terapéutico en el campo de la ELA. Se proporcionan instrucciones en video para los pasos más desafiantes de este protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hasta la fecha, los métodos basados en hiPSC y MEA para registros electrofisiológicos de cocultivos astrocito-neurona han encontrado una aplicación limitada en el campo de ALS6 y aún no en plataformas completamente humanas, en contraste con su uso más generalizado para el modelado in vitro de la epilepsia9. Esta plataforma, sin embargo, tiene el potencial de abordar cuestiones fisiopatológicamente relevantes en la investigación de la ELA, como los mecanismos…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este manuscrito fue respaldado por lo siguiente: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Career Development Award (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Agradecemos al Dr. Raha Dastgheyb y al Dr. Norman Haughey por proporcionar la plataforma MEA y el software de análisis de datos que hemos utilizado para validar la plataforma electrofisiológica descrita. Nos gustaría agradecer a Khalil Rust por su ayuda con la demostración del protocolo y la filmación.
Materials
| 10 cm sterile culture plates | Falcon | 353003 | |
| 25 cm2 sterile culture flasks | Falcon | 353136 | |
| 2-Mercaptoethanol (β-ME) | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 110 µM |
| 500 mL 0.2 µm CA Filter System | Corning | 430769 | |
| 5 mL pipette | Falcon | 357543 | |
| 6 well sterile culture plates | Falcon | 3046 | |
| Amphotericine B | Gibco | 15290018 | Working concentration 2.0 μg/mL |
| Anionic detergent with protease enzyme – Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Working concentration 1% m/v |
| Ascorbic acid (ASAC) | Sigma | A4403 | Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL). |
| Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) | Axion | OPT-24 | |
| Axion Edge MEA platform | Axion | Maestro Edge | |
| Basement Membrane matrix – Matrigel | Corning | 354277 | Details in the protocol |
| Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) | Zeiss | 415510-1100-000 | Primo Vert |
| Bicuculline | Sigma Aldrich | 14340 | Working concentration10 μM |
| Ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| CO2 tanks and regulator for Axion Edge | AirGas/Harris | 9296NC | |
| Compound E | Abcam | ab142164 | Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM). |
| Cyanquixaline (CNQX) | Sigma Aldrich | C239 | Working concentration 50 μM |
| Dihydrokainic acid (DHK) | Tocris | 111 | Working concentration 50 μM and 300 μM |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 113300 | Working concentration 1x |
| Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement | Thermofisher | A1517001 | Combine 10 mL of Essential 8 (10x) supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermofisher | 16140071 | Working concentration 1x |
| Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Hemocytometer | Election Microscopy Sciences | 63510-20 | |
| Heparin | Millipore-sigma | H3149-100KU | Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL). |
| Humidity controlled Cell culture incubator | ThermoFisher | 370 | set to 37 ºC, 5 % CO2 |
| Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R&D systems | 291-G1-200 | Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Kainc acid | Abcam | ab144490 | Working concentration 5 μM |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10828 | Working concentration 1x |
| Laminin | Thermofisher | 23017-015 | Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media) |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution |
| L-Glutamine | Thermofisher | 25030 | Working concentration 100x |
| MEA glass plates | MultiChannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti-gr | |
| Multichannel Pipet P200 | Gilson | PJ22224 | |
| Neurobasal | Thermofisher | 21103049 | Working concentration 1x |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermofisher | 11140050 | Working concentration 100x |
| Pencillin/Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | Working concentration 100x |
| Polyornithine (PLO) | Sigma-Aldrich | P3655 | Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL) |
| Potassium chloride (KCl) | NA | NA | Working concentration100 mM |
| Purmorphamine (PMN) | Millipore-Sigma | 540223 | Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM). |
| Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM). |
| ROCK-I nhibitor | Peprotech | 1293823 | Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM). |
| SB431542 | Sigma | S4317 | Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM) |
| Sterile cell culture hoods | Baker Company | SG-600 | |
| Supplement B – B27 Supplement | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 50x |
| Supplement N – N2 Supplement | Thermofisher | 17502048 | Working concentration 100x |
| Table top cell culture centrifuge | ThermoFisher | 75004261 | Sorvall Legend X1R |
| Thermoplastic film – Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
| Tissue dissociation protease – Dispase | StemCell Technologies | 7923 | Working concentration 1x |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL). |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher | 2530054 | Working concentration 1x |
| Waterbath | ThermoFisher | 2332 | Isotemp |
Referencias
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