Mise en place d’une plateforme électrophysiologique pour la modélisation de la SLA avec des astrocytes et des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes humaines spécifiques à une région
Summary
Nous décrivons une méthode de différenciation des astrocytes et des neurones dérivés pluripotents induits par l’homme et leur co-culture pour l’enregistrement électrophysiologique.
Abstract
Les astrocytes et les neurones (hiPSC-A) et les neurones (hiPSC-N) humains pluripotents fournissent un outil puissant pour modéliser la physiopathologie de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) in vitro. Les enregistrements à réseaux multi-électrodes (MEA) sont un moyen d’enregistrer les potentiels de champ électrique de grandes populations de neurones et d’analyser l’activité du réseau au fil du temps. Il a été précédemment démontré que la présence d’hiPSC-A différenciés à l’aide de techniques visant à promouvoir un phénotype d’astrocyte de la moelle épinière améliorait la maturation et l’activité électrophysiologique des neurones moteurs hiPSC (MN) de la moelle épinière spécifiques à une région par rapport à ceux cultivés sans hiPSC-A ou en présence d’astrocytes de rongeurs. La méthode décrite ici est une méthode de co-culture de la moelle épinière hiPSC-A avec hiPSC-MN et d’enregistrement de l’activité électrophysiologique à l’aide d’enregistrements MEA. Alors que les protocoles de différenciation décrits ici sont spécifiques aux astrocytes et aux neurones qui sont régionalement spécifiques à la moelle épinière, la plateforme de co-culture peut être appliquée aux astrocytes et aux neurones différenciés avec des techniques spécifiques à d’autres destins, y compris l’hiPSC-A cortical et l’hiPSC-N. Ces protocoles visent à fournir un test électrophysiologique pour informer sur les interactions glia-neurones et fournir une plate-forme pour tester des médicaments ayant un potentiel thérapeutique dans la SLA.
Introduction
Les astrocytes et les neurones (hiPSC-A) et les neurones (hiPSC-N) sont des outils puissants pour modéliser la physiopathologie de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) in vitro et fournissent un paradigme translationnel pour les stratégies de découverte de médicaments1. Les chercheurs ont démontré que la co-culture de l’hiPSC-A avec l’hiPSC-N améliore la maturation morphologique, moléculaire, électrophysiologique et pharmacologique des deux types cellulaires, générant des réseaux neuronaux complexes et des interactions astrocyte-neurones qui ressemblent à leurs homologues in vivo 2,3. Des expériences de co-culture similaires peuvent récapituler les caractéristiques de la pathobiologie de la SLA telles que la neurotoxicité médiée par les astrocytes 4,5 et l’hyperexcitabilité neuronale6. De plus, avec les progrès des protocoles de différenciation, les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC) peuvent être différenciées en sous-types neuronaux spécifiques à la région, y compris les cellules souches corticales et épinières hiPSC-A et hiPSC-N 7,8. Ces stratégies offrent le potentiel de modélisation de la pathologie des motoneurones corticaux et spinaux dans la SLA, ainsi que l’influence astrocytaire sur les deux. Cependant, cela nécessite qu’il existe un essai fonctionnel reproductible pour déterminer ces effets.
Récemment, il a été démontré que l’enregistrement multi-électrodes (MEA) est particulièrement adapté à la caractérisation électrophysiologique des co-cultures neurone-astrocyte2. Contrairement aux analyses électrophysiologiques unicellulaires, ces réseaux d’électrodes à haute densité enregistrent passivement les potentiels de champ extracellulaire de grandes populations de neurones sans perturber les conditions de culture et préserver l’intégrité des membranes cellulaires. Ces plateformes sont particulièrement utiles pour enregistrer l’activité cellulaire et en réseau des cultures au fil du temps et en réponse à des manipulations pharmacologiques. Enfin, lorsque la présence d’astrocytes est une variable de culture, les enregistrements MEA peuvent fournir des informations fonctionnelles sur les interactions bidirectionnelles astrocyte-neurone 2,9.
Présenté ici est un protocole optimisé pour la différenciation de l’hiPSC en hiPSC-A de la moelle épinière et hiPSC-motoneurones (MN) qui a été précédemment validé2. Le protocole de différenciation hiPSC-A de la moelle épinière aboutit systématiquement à des cultures d’astrocytes, qui sont positives pour la protéine B liant le calcium S100 (S100β), la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et l’Homeobox B4 (HOXB4) dans jusqu’à 80 %, 50 % et 90 % des cellules, respectivement, ce qui indique une spécification gliale et moelle épinière en cours de maturation 2,10 . Le protocole de différenciation hiPSC-MN génère des neurones positifs à >90% pour la choline acétyltransférase (ChAT), suggérant une identité de motoneurone alphamature 2. En outre, le protocole décrit des techniques pour la génération de co-cultures hiPSC-A/MN dont il a été démontré précédemment qu’elles aboutissaient à des neurones présentant une complexité morphologique accrue par analyse Scholl et microscopie immunofluorescente par rapport à des cultures neuronales sans astrocytes ou avec des astrocytes de rongeurs2. Bien que ces descriptions soient spécifiques à la moelle épinière hiPSC-A et hiPSC-N, un avantage unique est que la culture indépendante initiale d’astrocytes et de neurones suivie d’étapes de co-culture à des moments ultérieurs peut être traduite pour étudier les effets des interactions neurone-astrocyte d’autres régions spécifiques ainsi que des cellules spécifiques à la maladie 7,8 . Enfin, le protocole décrit comment cultiver ces cultures sur des plaques MEA afin que l’activité fonctionnelle en tant que facteur de composition de co-culture puisse être étudiée dans le temps avec la capacité de manipuler la composition cellulaire ainsi que les conditions de culture.
L’objectif de ces protocoles est de fournir un test fonctionnel pour étudier les interactions astrocyte-neurone, examiner les changements spécifiques à la maladie et tester des médicaments ayant un potentiel thérapeutique dans le domaine de la SLA. Des instructions vidéo sont fournies pour les étapes les plus difficiles de ce protocole.
Protocol
Representative Results
Discussion
À ce jour, les méthodes basées sur les HIPSC et MEA pour les enregistrements électrophysiologiques des co-cultures astrocyte-neurones ont trouvé une application limitée dans le domaine de la SLA6 et toujours pas dans des plates-formes entièrement humaines, contrairement à leur utilisation plus répandue pour la modélisation in vitro de l’épilepsie9. Cette plateforme a toutefois le potentiel de répondre à des questions pathophysiologiquement pertinente…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce manuscrit a été soutenu par ce qui suit : 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Career Development Award (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Nous remercions la Dre Raha Dastgheyb et le Dr Norman Haughey d’avoir fourni la plateforme MEA et le logiciel d’analyse de données que nous avons utilisés pour valider la plateforme électrophysiologique décrite. Nous tenons à remercier Khalil Rust pour leur aide dans la démonstration du protocole et le tournage.
Materials
| 10 cm sterile culture plates | Falcon | 353003 | |
| 25 cm2 sterile culture flasks | Falcon | 353136 | |
| 2-Mercaptoethanol (β-ME) | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 110 µM |
| 500 mL 0.2 µm CA Filter System | Corning | 430769 | |
| 5 mL pipette | Falcon | 357543 | |
| 6 well sterile culture plates | Falcon | 3046 | |
| Amphotericine B | Gibco | 15290018 | Working concentration 2.0 μg/mL |
| Anionic detergent with protease enzyme – Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Working concentration 1% m/v |
| Ascorbic acid (ASAC) | Sigma | A4403 | Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL). |
| Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) | Axion | OPT-24 | |
| Axion Edge MEA platform | Axion | Maestro Edge | |
| Basement Membrane matrix – Matrigel | Corning | 354277 | Details in the protocol |
| Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) | Zeiss | 415510-1100-000 | Primo Vert |
| Bicuculline | Sigma Aldrich | 14340 | Working concentration10 μM |
| Ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| CO2 tanks and regulator for Axion Edge | AirGas/Harris | 9296NC | |
| Compound E | Abcam | ab142164 | Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM). |
| Cyanquixaline (CNQX) | Sigma Aldrich | C239 | Working concentration 50 μM |
| Dihydrokainic acid (DHK) | Tocris | 111 | Working concentration 50 μM and 300 μM |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 113300 | Working concentration 1x |
| Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement | Thermofisher | A1517001 | Combine 10 mL of Essential 8 (10x) supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermofisher | 16140071 | Working concentration 1x |
| Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Hemocytometer | Election Microscopy Sciences | 63510-20 | |
| Heparin | Millipore-sigma | H3149-100KU | Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL). |
| Humidity controlled Cell culture incubator | ThermoFisher | 370 | set to 37 ºC, 5 % CO2 |
| Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R&D systems | 291-G1-200 | Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Kainc acid | Abcam | ab144490 | Working concentration 5 μM |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10828 | Working concentration 1x |
| Laminin | Thermofisher | 23017-015 | Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media) |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution |
| L-Glutamine | Thermofisher | 25030 | Working concentration 100x |
| MEA glass plates | MultiChannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti-gr | |
| Multichannel Pipet P200 | Gilson | PJ22224 | |
| Neurobasal | Thermofisher | 21103049 | Working concentration 1x |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermofisher | 11140050 | Working concentration 100x |
| Pencillin/Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | Working concentration 100x |
| Polyornithine (PLO) | Sigma-Aldrich | P3655 | Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL) |
| Potassium chloride (KCl) | NA | NA | Working concentration100 mM |
| Purmorphamine (PMN) | Millipore-Sigma | 540223 | Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM). |
| Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM). |
| ROCK-I nhibitor | Peprotech | 1293823 | Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM). |
| SB431542 | Sigma | S4317 | Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM) |
| Sterile cell culture hoods | Baker Company | SG-600 | |
| Supplement B – B27 Supplement | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 50x |
| Supplement N – N2 Supplement | Thermofisher | 17502048 | Working concentration 100x |
| Table top cell culture centrifuge | ThermoFisher | 75004261 | Sorvall Legend X1R |
| Thermoplastic film – Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
| Tissue dissociation protease – Dispase | StemCell Technologies | 7923 | Working concentration 1x |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL). |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher | 2530054 | Working concentration 1x |
| Waterbath | ThermoFisher | 2332 | Isotemp |
Referencias
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