Oprichting van een elektrofysiologisch platform voor het modelleren van ALS met regionaal specifieke menselijke pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten en neuronen
Summary
We beschrijven een methode voor het differentiëren van door het ruggenmerg geïnduceerde pluripotent-afgeleide astrocyten en neuronen en hun co-cultuur voor elektrofysiologische registratie.
Abstract
Menselijke pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten (hiPSC-A) en neuronen (hiPSC-N) bieden een krachtig hulpmiddel voor het modelleren van Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) pathofysiologie in vitro. Multi-electrode array (MEA) opnames zijn een middel om elektrische veldpotentialen van grote populaties neuronen vast te leggen en netwerkactiviteit in de loop van de tijd te analyseren. Eerder werd aangetoond dat de aanwezigheid van hiPSC-A die worden gedifferentieerd met behulp van technieken om een ruggenmerg astrocytenfenotype te bevorderen, de rijping en elektrofysiologische activiteit van regionaal specifieke hiPSC-motorneuronen (MN) van het ruggenmerg verbeterde in vergelijking met die gekweekt zonder hiPSC-A of in de aanwezigheid van knaagdierastrocyten. Hier beschreven is een methode om ruggenmerg hiPSC-A te co-kweken met hiPSC-MN en elektrofysiologische activiteit te registreren met behulp van MEA-opnames. Hoewel de hier beschreven differentiatieprotocollen specifiek zijn voor astrocyten en neuronen die regionaal specifiek zijn voor het ruggenmerg, kan het co-kweekplatform worden toegepast op astrocyten en neuronen die zijn gedifferentieerd met technieken die specifiek zijn voor andere lotgevallen, waaronder corticale hiPSC-A en hiPSC-N. Deze protocollen hebben tot doel een elektrofysiologische test te bieden om te informeren over interacties tussen glia en neuronen en een platform te bieden voor het testen van geneesmiddelen met therapeutisch potentieel bij ALS.
Introduction
Menselijke pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten (hiPSC-A) en neuronen (hiPSC-N) zijn krachtige hulpmiddelen voor het modelleren van Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) pathofysiologie in vitro en bieden een translationeel paradigma voor strategieën voor het ontdekken van geneesmiddelen1. Onderzoekers hebben aangetoond dat de co-cultuur van hiPSC-A met hiPSC-N de morfologische, moleculaire, elektrofysiologische en farmacologische rijping van beide celtypen verbetert, waardoor complexe neuronale netwerken en astrocyten-neuroninteracties worden gegenereerd die lijken op hun in vivo tegenhangers 2,3. Vergelijkbare co-kweekexperimenten kunnen kenmerken van ALS-pathobiologie samenvatten, zoals astrocytengemedieerde neurotoxiciteit 4,5 en neuronale hyper-exciteerbaarheid6. Bovendien, met vooruitgang in differentiatieprotocollen, kunnen door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) worden gedifferentieerd in regionaal specifieke neurale subtypen, waaronder corticale en ruggenmerg hiPSC-A en hiPSC-N 7,8. Deze strategieën bieden het potentieel voor het modelleren van corticale en spinale motorneuronpathologie bij ALS, evenals de astrocytische invloed op beide. Dit vereist echter dat er een reproduceerbare functionele test is om deze effecten te bepalen.
Onlangs werd aangetoond dat multi-elektrode array (MEA) opname bijzonder geschikt is voor de elektrofysiologische karakterisering van neuron-astrocyten co-culturen2. In tegenstelling tot eencellige elektrofysiologische analyses, registreren deze elektrode-arrays met hoge dichtheid passief extracellulaire veldpotentialen van grote populaties neuronen zonder de kweekomstandigheden te verstoren en de integriteit van celmembranen te behouden. Deze platforms zijn vooral nuttig voor het registreren van de cellulaire en netwerkactiviteit van culturen in de loop van de tijd en als reactie op farmacologische manipulatie. Ten slotte, wanneer de aanwezigheid van astrocyten een cultuurvariabele is, kunnen MEA-opnames functionele inzichten bieden in bidirectionele interacties tussen astrocyten en neuronen 2,9.
Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor de differentiatie van hiPSC in ruggenmerg hiPSC-A en hiPSC-motorneuronen (MN) dat eerder is gevalideerd2. Het hiPSC-A-differentiatieprotocol van het ruggenmerg resulteert consequent in astrocytenculturen, die positief zijn voor S100 calciumbindend eiwit B (S100β), gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) en Homeobox B4 (HOXB4) in respectievelijk maximaal 80%, 50% en 90% van de cellen, wat wijst op een rijpende gliale en ruggenmergspecificatie 2,10 . Het hiPSC-MN differentiatieprotocol genereert neuronen die >90% positief zijn voor choline-acetyltransferase (ChAT), wat wijst op een volwassen alfa-motorneuronidentiteit2. Daarnaast beschrijft het protocol technieken voor het genereren van hiPSC-A/MN co-culturen waarvan eerder is aangetoond dat ze resulteren in neuronen met verbeterde morfologische complexiteit door Scholl-analyse en immunofluorescente microscopie in vergelijking met neuronale culturen zonder astrocyten of met knaagdierastrocyten2. Hoewel deze beschrijvingen specifiek zijn voor het ruggenmerg hiPSC-A en hiPSC-N, is een uniek voordeel dat de initiële onafhankelijke cultuur van astrocyten en neuronen gevolgd door stappen om op latere tijdstippen te co-kweken, kan worden vertaald om de effecten van neuron-astrocyteninteracties uit andere specifieke regio’s en ziektespecifieke cellen te bestuderen 7,8 . Ten slotte beschrijft het protocol hoe deze culturen op MEA-platen kunnen worden gekweekt, zodat functionele activiteit als een factor van co-cultuursamenstelling in de loop van de tijd kan worden bestudeerd met het vermogen om de cellulaire samenstelling en kweekomstandigheden te manipuleren.
Het doel van deze protocollen is om een functionele test te bieden om astrocyten-neuron interacties te onderzoeken, ziektespecifieke veranderingen te onderzoeken en geneesmiddelen met therapeutisch potentieel op het gebied van ALS te testen. Video-instructies zijn voorzien voor de meest uitdagende stappen van dit protocol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tot op heden hebben hiPSC- en MEA-gebaseerde methoden voor elektrofysiologische opnames van astrocyten-neuron co-culturen een beperkte toepassing gevonden op het gebied van ALS6 en nog steeds niet in volledig menselijke platforms, in tegenstelling tot hun meer wijdverspreide gebruik voor in vitro modellering van epilepsie9. Dit platform heeft echter het potentieel om pathofysiologisch relevante vragen in ALS-onderzoek aan te pakken, zoals de mechanismen van neurona…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit manuscript werd ondersteund door het volgende: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH / NINDS (CWH), 2020 Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Career Development Award (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). We bedanken Dr. Raha Dastgheyb en Dr. Norman Haughey voor het leveren van het MEA-platform en de data-analysesoftware die we hebben gebruikt om het beschreven elektrofysiologische platform te valideren. We willen Khalil Rust bedanken voor hun hulp bij protocoldemonstraties en filmen.
Materials
| 10 cm sterile culture plates | Falcon | 353003 | |
| 25 cm2 sterile culture flasks | Falcon | 353136 | |
| 2-Mercaptoethanol (β-ME) | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 110 µM |
| 500 mL 0.2 µm CA Filter System | Corning | 430769 | |
| 5 mL pipette | Falcon | 357543 | |
| 6 well sterile culture plates | Falcon | 3046 | |
| Amphotericine B | Gibco | 15290018 | Working concentration 2.0 μg/mL |
| Anionic detergent with protease enzyme – Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Working concentration 1% m/v |
| Ascorbic acid (ASAC) | Sigma | A4403 | Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL). |
| Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) | Axion | OPT-24 | |
| Axion Edge MEA platform | Axion | Maestro Edge | |
| Basement Membrane matrix – Matrigel | Corning | 354277 | Details in the protocol |
| Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) | Zeiss | 415510-1100-000 | Primo Vert |
| Bicuculline | Sigma Aldrich | 14340 | Working concentration10 μM |
| Ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| CO2 tanks and regulator for Axion Edge | AirGas/Harris | 9296NC | |
| Compound E | Abcam | ab142164 | Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM). |
| Cyanquixaline (CNQX) | Sigma Aldrich | C239 | Working concentration 50 μM |
| Dihydrokainic acid (DHK) | Tocris | 111 | Working concentration 50 μM and 300 μM |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 113300 | Working concentration 1x |
| Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement | Thermofisher | A1517001 | Combine 10 mL of Essential 8 (10x) supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermofisher | 16140071 | Working concentration 1x |
| Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Hemocytometer | Election Microscopy Sciences | 63510-20 | |
| Heparin | Millipore-sigma | H3149-100KU | Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL). |
| Humidity controlled Cell culture incubator | ThermoFisher | 370 | set to 37 ºC, 5 % CO2 |
| Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R&D systems | 291-G1-200 | Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Kainc acid | Abcam | ab144490 | Working concentration 5 μM |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10828 | Working concentration 1x |
| Laminin | Thermofisher | 23017-015 | Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media) |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution |
| L-Glutamine | Thermofisher | 25030 | Working concentration 100x |
| MEA glass plates | MultiChannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti-gr | |
| Multichannel Pipet P200 | Gilson | PJ22224 | |
| Neurobasal | Thermofisher | 21103049 | Working concentration 1x |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermofisher | 11140050 | Working concentration 100x |
| Pencillin/Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | Working concentration 100x |
| Polyornithine (PLO) | Sigma-Aldrich | P3655 | Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL) |
| Potassium chloride (KCl) | NA | NA | Working concentration100 mM |
| Purmorphamine (PMN) | Millipore-Sigma | 540223 | Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM). |
| Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM). |
| ROCK-I nhibitor | Peprotech | 1293823 | Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM). |
| SB431542 | Sigma | S4317 | Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM) |
| Sterile cell culture hoods | Baker Company | SG-600 | |
| Supplement B – B27 Supplement | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 50x |
| Supplement N – N2 Supplement | Thermofisher | 17502048 | Working concentration 100x |
| Table top cell culture centrifuge | ThermoFisher | 75004261 | Sorvall Legend X1R |
| Thermoplastic film – Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
| Tissue dissociation protease – Dispase | StemCell Technologies | 7923 | Working concentration 1x |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL). |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher | 2530054 | Working concentration 1x |
| Waterbath | ThermoFisher | 2332 | Isotemp |
Referencias
- Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).
- Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
- Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
- Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
- Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
- Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
- Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
- Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
- Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).
- Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
- Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
- Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
- Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
- Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).
