Кальций и гемодинамическая визуализация перицитов головного мозга у трансгенных мышей In Vivo
Summary
В этом протоколе представлены шаги по получению и анализу флуоресцентных изображений кальция из перицитов головного мозга и данных кровотока из близлежащих кровеносных сосудов у анестезируемых мышей. Эти методы полезны для изучения физиологии муло-клеток и могут быть адаптированы для исследования переходных процессов кальция в любом типе клеток.
Abstract
Последние достижения в области белковой биологии и генетики мышей позволили измерить внутриклеточные колебания кальция клеток мозга in vivo и соотнести это с местной гемодинамикой. Этот протокол использует трансгенных мышей, которые были подготовлены с хроническим черепным окном и экспрессируют генетически закодированный индикатор кальция, RCaMP1.07, под α промотором актина гладкой мускулатуры, чтобы специфически маркировать настенные клетки, такие как гладкомышечные клетки сосудов и перициты. Описаны шаги о том, как подготовить катетер хвостовой вены к внутривенному введению флуоресцентных красителей для отслеживания кровотока, а также как измерить кальций перицита мозга и местную гемодинамику кровеносных сосудов (диаметр, скорость эритроцитов и т. Д.) С помощью двух фотонных микроскопий in vivo через краниальное окно у мышей, обезболенных кетамином / ксилазином. Наконец, предоставляются подробности для анализа колебаний кальция и фильмов кровотока с помощью алгоритмов обработки изображений, разработанных Barrett et al. 2018, с акцентом на то, как эти процессы могут быть адаптированы к другим данным клеточной визуализации.
Introduction
Сосудистая система центральной нервной системы состоит из проникающих артериол, капилляров и восходящих венул. В рамках этой сети муральные клетки, такие как гладкомышечные клетки сосудов, заражая артериолы и перициты, расширяют клеточные процессы вдоль первых ветвей артериол и капилляров1. Перициты, по-видимому, играют несколько ролей в мозге, включая поддержание гематоэнцефалического барьера1,2,миграцию иподвижность 3,потенциальные свойства стволовых клеток и регуляцию мозгового кровотока4,5,6. Многие из функциональных ролей перицитов были связаны с колебаниями внутриклеточного кальция, которые могут регулировать расширение или сокращение этих клеток4,5,6.
В нескольких недавних исследованиях были установлены критерии для идентификации различных типов перицитов мозга7,8. Муральные клетки в пределах первых 4 ветвей проникающих артериол являются обволакивающими перицитами на основе их экспрессии сократительного белка α-гладкомышечные актины (αSMA) и их выступающих, яйцевидных соматов с отростками, которые оборачиваются вокруг сосудов7,8,9. Для визуализации колебаний кальция в перицитах, этот протокол использует новую трансгенную линию мыши Acta2-RCaMP1.07, также известную как Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J10. Эти мыши экспрессируют красный генетически закодированный индикатор кальция, RCaMP1.07, в клетках, экспрессивиющих αSMA (клетках гладкой мускулатуры сосудов и перицитах). Племенные колонии поддерживаются путем скрещивания ненесующих животных с гемизиготами. RCaMP1.07 представляет собой красный флуоресцентный белок с связывающим кальмодулином доменом, который увеличивает флуоресценцию при связывании с внутриклеточным кальцием10,11. В этом протоколе описываются этапы комбинированной кальциевой визуализации перицитов и измерения кровотока с помощью двух фотонной микроскопии, включая процедуры инъекции флуоресцентных красителей в хвостовую вену, получение изображений микроскопом у анестезируемых мышей и анализ данных с помощью программных платформ(рисунок 1). Эти методы полезны для решения вопросов о физиологии муло-клеток, но могут быть адаптированы для изучения переходных процессов кальция в любом типе клеток в мозге или другой системе органов.
Для эксперимента, представленного в этой статье, использовалась 10-месячная самка мыши Acta2-RCaMP1.07. Мышь перенесла операцию по поводу хронического черепного окна и головы после имплантации за два месяца до этого. Детали хирургического протокола обсуждаются в предыдущих исследованиях12,13 и аналогичные процедуры были выполнены в других ранее опубликованных протоколах14,15. Сосудистая процедура маркируется зеленым флуоресцеином-декстраном (70 000 МВт, антионный раствор, 2,5% мас./об.), вводимым внутривенно. Этот краситель является экономически эффективным и легко доступным из коммерческих источников, но он имеет более широкий спектр излучения, который может перекрываться с излучением RCaMP и пропускаться во время получения изображения микроскопом. Шаги для спектрального размешивания описаны в разделе 4 ниже, чтобы обойти это, но также могут использоваться другие зеленые красители с более узкими спектрами излучения, такие как те, которые основаны на EGFP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящий способ предоставляет подробную информацию об инъекции в вену хвоста мыши с помощью катетера, двухфотонном микроскопе получения изображений для глубинных стеков, клеточных кальциевых сигнальных фильмов, создании гемодинамических кимографов, а также кальциевом и гемодинамическом анализе с помощью наших алгоритмов обработки изображений17 (фиг.1). У этих методов есть несколько преимуществ, которые улучшают результат визуализации in vivo и сокращают время, ресурсы и стресс животных во время сеанса. Во-первых, использование катетера для инъекции в хвостовую вену обеспечивает больший контроль над иглой, шприцем и количеством вещества, вводимого в кровообращение мыши. Кроме того, он предотвращает инъекцию красителя в ткань хвоста, экономя дорогостоящие реагенты. Во-вторых, мы используем трансгенных мышей, которые экспрессируют генетически закодированные датчики кальция в перицитах и демонстрируют, как локализовать их в сосудистой сети мозга с помощью глубинного z-стека, что облегчает идентификацию и перемещение клеток в последующих сеансах визуализации в долгосрочной перспективе. Это является важным фактором в исследованиях перицитов и обеспечивает правильную классификацию клеток6,7. В-третьих, мы предоставляем наши параметры для сбора кальциевых фильмов и данных сканирования гемодинамических линий, которые являются хорошей отправной точкой для измерения динамических клеточных сигналов. Наконец, мы представляем наши алгоритмы обработки изображений17,комплексный набор инструментов для обработки изображений, который содержит несколько подходов к предварительной обработке изображений (например, спектральное размешивание), анализ изображений кальция и гемодинамический анализ (диаметр, скорость и т. Д.). Эти алгоритмы могут генерировать графики для быстрой и простой визуализации данных, сводя к минимуму уровень знаний пользователей, необходимых для анализа результатов. Кроме того, он может быть автоматизирован с помощью нескольких строк кода для быстрой пакетной обработки нескольких наборов данных с одинаковыми параметрами. Это может потенциально улучшить визуализацию данных и временные вложения исследователя.
Ключом к сбору хороших данных визуализации кальция является настройка мощности лазера и PMT для получения четкого флуоресцентного сигнала, а также сбор данных с достаточной частотой кадров для захвата всего события кальция. Данные в этом протоколе были получены со скоростью 10-11 кадров в секунду, что фиксирует более медленные колебания кальция в перицитах. Существует также несколько шагов во время анализа, которые могут улучшить результат анализа. Во-первых, спектральное размешивание полезно, если существует значительное перекрытие между спектрами излучения флуорофоров(рисунок 2). Флуоресцеин-декстран был использован в этом протоколе, потому что он является экономически эффективным и коммерчески доступным конъюгатом декстрана, который обычно используется для гемодинамических измерений5. Спектральное размешивание помогает очистить данные для улучшенного обнаружения сигналов кальция, но также могут быть использованы альтернативные флуорофоры с более узкими спектрами излучения. Во-вторых, ручной выбор клеточных структур в качестве ROI(рисунок 3)полезен для классификации событий кальция в различных субклеточных областях, таких как сома или ветви процесса. Выбор ROI на основе активности(рисунок 4)16 предоставляет больше пространственной и временной информации об отдельных событиях кальция. Это может быть полезно при определении частоты событий кальция в данной области или распространении событий на другие клеточные области. Использование программного обеспечения для анализа данных изображений может сэкономить исследователям часы времени, когда данные обрабатываются пакетно, но для настройки параметров для достижения оптимальных результатов требуются некоторые первоначальные временные вложения. Наиболее важными факторами являются ожидаемый размер (вмкм2)активной области, а также продолжительность сигнала (необходимо определить минимальное время сигнала и максимальное время сигнала). Исследователи должны сначала изучить некоторые примеры фильмов серии T, чтобы наилучшим образом определить, какие параметры соответствуют их данным. Наконец, данные низкого качества, полученные на микроскопе, могут значительно затруднить анализ кальция и гемодинамики(рисунок 6). Поэтому следует позаботиться об оптимизации настроек сбора микроскопа в начале. Имея в виду эти факторы, этот протокол может быть адаптирован для визуализации кальция или анализа других динамических клеточных сигналов (например, флуоресцентных натрия, калия, метаболитов или колебаний напряжения) в других тканях или типах клеток.
У этого протокола есть несколько ограничений. Во-первых, данные собираются под наркозом, что влияет на активность мозга и может повлиять на кровоток. Аналогичная визуализация может быть сделана у бодрствующих мышей, которые обучены принимать фиксацию головы для более физиологических результатов. Кроме того, важно помнить, что мы собираем 2-мерные изображения 3-мерной клетки и кровеносного сосуда in vivo. Таким образом, мы можем захватить только фракцию кальциевых событий в этих клетках или кровоток в одном участке кровеносного сосуда за раз.
Еще одно ограничение, которое следует отметить, заключается в том, что двухфотонная визуализация кальция чувствительна к артефактам движения, где движение в фокальной плоскости и из нее может быть ошибочно принято за колебания кальция. Этот протокол выполнялся под наркозом, который ограничивал движение животного; однако артефакты движения могут быть введены по частоте дыхания мыши, частоте сердечных сокращений, возможному отеку тканей, а в случае окутывающих перицитов — по сокращению сосудов или вазомоции 4,6,18,19. Артефакты движения могут быть смягчены несколькими стратегиями. Пакеты обработки изображений, используемые в этом протоколе, включают дополнительный этап коррекции движения, который использует механизм 2D-свертки для выравнивания изображений в пределах T-серии на основе видимой сосудистой системы13,17. Кадры со значительными изменениями в фокальной плоскости идентифицируются этим алгоритмом и могут быть исключены из анализа. Кроме того, можно использовать статистические стратегии в пакетах обработки изображений, такие как Z-оценка при генерации флуоресцентных следов для нормализации флуктуаций кальция, вызванных движением20. Наиболее надежным подходом к учету артефактов движения в двухфотонной визуализации является объединение экспрессии двух флуоресцентных индикаторов в одной клетке, таких как индикатор кальция (например, GCaMP) и флуоресцентный репортер (например, mCherry), который не зависит от кальция. Флуктуации в флуоресцентном репортере затем могут быть отнесены к движению и вычитаются из сигнала индикатора кальция для нормализации артефактов движения.
Цель этого протокола – обеспечить четкое понимание того, как собирать оптимальные данные визуализации кальция и кровотока in vivo, а также представить новые методы и инструменты анализа, которые исследователи могут реализовать для улучшения своих результатов. Эти методы могут быть применены для изучения роли различных популяций перицитов в контроле кровотока или в различных состояниях заболеваний головного мозга. Эти параметры визуализации также могут быть использованы для изучения кальция и кровотока в других типах клеток и системах органов, и аналогичные принципы применяются к другим методам динамической визуализации, которые стали возможными благодаря другим генетически закодированным датчикам, помимо кальция.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Meza поддерживается стипендиями mitacs и Research Manitoba. Финансирование этой работы было предоставлено Канадскими институтами исследований в области здравоохранения, Исследовательской организацией Манитобы, Фондом медицинской службы Манитобы, стартовым финансированием от Университета Манитобы и Brain Canada через Канадский фонд исследований мозга при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Канады и Фонда Азриэли. Мнения, выраженные в настоящем документе, не обязательно отражают точку зрения министра здравоохранения или правительства Канады.
Materials
| Acta2-RCaMP1.07 | The Jackson Laboratory | 28345 | In the video protocol the animal model used is a female mouse of 10 months, 1 day old. |
| Applicators (Regular) | Bisco | X-80250P | |
| BioFormats package for MATLAB | NA | NA | Denominated in this protocol as "image processing packages". Available in: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/ |
| CHIPS MATLAB toolbox | NA | NA | Denomitaded in this protocol as "image processing algorithms". Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: an Extensible Toolbox for Cellular and Hemodynamic Two-Photon Image Analysis. Neuroinformatics. 2018;16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. Available in: https://github.com/EIN-lab/CHIPS |
| Clear Ultrasound Gel, Medium viscosity | HealthCare Plus | UGC250 | |
| Dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| Dextran, Texas Red, 70,000 MW, neutral | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| Eye Lube Plus | Optixcare | NA | |
| FIJI | Image J | NA | Denominated in this protocol as "image processor software". Available in: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| GCaMP6sfl/fl | The Jackson Laboratory | ||
| Head Post fixing platform | University of Zurich | NA | |
| Ketamine (Narketan 100 mg/mL) | Vetoquinol | 440893 | |
| MATLAB R2020b | NA | Denominated in this protocol as "programming platform ". Available in: https://www.mathworks.com/downloads/ | |
| Needle 0.3mmx25mm | BD PrecisionGlide | 305128 | |
| Objective XLUMPLFLN20XW | Olympus | NA | https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/ |
| PDGFRβ-CreERT2 | The Jackson Laboratory | 30201 | |
| Polyethylene Tubing, PE10 I.D. 28mm (0.11”) O.D. 61mm (.024”) | BD Intramedic | 427401 | |
| Prairie View | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
| Ultima In Vitro Multiphoton Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
| Under Tank Heater | Reptitherm U.T.H | E169064 | |
| Xylazine (Rompun 20 mg/mL) | Bayer HealthCare | 2169592 |
Referencias
- Armulik, A., Genové, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Berthiaume, A. -. A., et al. Dynamic remodeling of pericytes in vivo maintains capillary coverage in the adult mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
- Rungta, R. L., Chaigneau, E., Osmanski, B. -. F. F., Charpak, S. Vascular compartmentalization of functional hyperemia from the synapse to the pia. Neuron. 99 (2), 362-375 (2018).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O’Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nature Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
- Gonzales, A. L., et al. Contractile pericytes determine the direction of blood flow at capillary junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 27022-27033 (2020).
- Hartmann, D. a., et al. Pericyte structure and distribution in the cerebral cortex revealed by high-resolution imaging of transgenic mice. Neurophotonics. 2 (4), 041402 (2015).
- Grant, R. I., et al. Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 39 (3), 411-425 (2017).
- Hill, R. A., Tong, L., Yuan, P., Murikinati, S., Gupta, S., Grutzendler, J. Regional blood flow in the normal and ischemic brain is controlled by arteriolar smooth muscle cell contractility and not by capillary pericytes. Neuron. 87 (1), 95-110 (2015).
- 28345 – STOCK Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J. Jackson Laboratory Available from: https://www.jax.org/strain/028345 (2021)
- Ohkura, M., Sasaki, T., Kobayashi, C., Ikegaya, Y., Nakai, J. An improved genetically encoded red fluorescent Ca2+ indicator for detecting optically evoked action potentials. PLoS ONE. 7 (7), (2012).
- Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
- Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. JoVE. (12), e680 (2008).
- Lin, X., et al. Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice. JoVE. (143), e56297 (2019).
- Ellefsen, K. L., Settle, B., Parker, I., Smith, I. F. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. 56 (3), 147-156 (2014).
- Barrett, M. J. P., Ferrari, K. D., Stobart, J. L., Holub, M., Weber, B. CHIPS: an extensible toolbox for cellular and hemodynamic two-photon image analysis. Neuroinformatics. 16, 145-147 (2018).
- Hall, C. N., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (1), 55-60 (2014).
- Nilsson, H., Aalkjaer, C. Vasomotion: mechanisms and physiological importance. Molecular interventions. 3 (2), 79-89 (2003).
- Rungta, R. L., et al. Vascular arbors in layer II / III somatosensory cortex. Communications Biology. , (2021).
