JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Inmunología y contagio

호흡기 멜리오이드증 동안 폐 기능을 특성화하기 위해 단순화 된 전신 혈량 검사

Published: February 24, 2023
doi:
10.3791/62722
,
1Department of Microbiology and Immunology,University of Louisville, 2Center for Predictive Medicine,University of Louisville

Summary

이 프로토콜은 세균성 호흡기 질환 진행을 비 침습적으로 모니터링하기 위해 단순화 된 전신 혈량 검사 장치의 구성 및 사용을 제시합니다.

Abstract

질병의 대리 동물 모델은 책임 연구의 3R의 적용을받습니다. 동물 복지와 과학적 통찰력이 새로운 기술의 가용성과 함께 발전할 수 있도록 동물 모델에 대한 개선을 자주 재검토하고 있습니다. 이 기사는 치명적인 호흡기 멜리오이드증 모델에서 호흡 부전을 비침습적으로 연구하기 위해 단순화된 전신 혈량 측정(sWBP)을 사용하는 방법을 보여줍니다. sWBP는 질병 경과 전체를 통해 마우스의 호흡을 감지하는 민감도를 가지고 있어 빈사 관련 증상(서맥 및 저호흡)을 측정하고 잠재적으로 인도적 종점 기준을 개발하는 데 사용할 수 있습니다.

호흡기 질환의 맥락에서 sWBP의 이점 중 일부는 숙주 호흡 모니터링이 1차 감염 조직, 즉 폐의 기능 장애를 평가할 때 생리학적 측정 중 가장 가깝다는 것입니다. 생물학적 중요성 외에도 sWBP의 사용은 신속하고 비침습적이어서 연구 동물의 스트레스를 최소화합니다. 이 연구는 호흡 멜리오이드증의 뮤린 모델에서 호흡 부전 과정 전반에 걸쳐 질병을 모니터링하기 위해 사내 sWBP 장치의 사용을 보여줍니다.

Introduction

호흡기 세균성 병원체는 종종 폐 병리 1,2로 이어지는 폐의 염증 반응과 관련이 있습니다. 임상 환경에서 폐렴 진단에는 일반적으로 객담, 혈중 산소 포화도 분석 및 흉부 X- 레이의 배양 기술이 포함됩니다. 이러한 기술은 작은 동물 감염 모델에 대해 번역될 수 있지만, 산소 포화도 분석만이 마우스에서 질병 중증도에 대한 신속한 실시간 분석을 나타낸다. 혈중 산소 포화도 (SpO2)는 호흡기 질환 연구에서 질병 진행을 추적하는 방법으로 이전에 조사되었습니다. 그러나, 빈사 상태의 마우스는 녹농균 모델3 모두에서 예기치 않게 높은 SpO2 판독 값을 가지며, 이는 마우스가 생리적 활성을 조절할 수 있기 때문에 예측 또는 빈사 질환이 아닙니다. 이를 위해 SpO2의 진단 수준은 지금까지 마우스의 세균성 호흡기 질환에 대해 발견되지 않았습니다.

따라서이 연구는 신속한 생리 학적 측정으로서 폐 기능에 대한 폐 질환의 영향을 검출하는 다른 임상 적으로 관련된 방법의 사용을 조사했다. 단순화된 전신 혈량측정법(sWBP)은 빠르고 비침습적인 생체 분석으로 호흡수와 깊이를 조사할 수 있는 기회를 제공합니다. 이전 연구는 실험실에서 WBP 장치를 조립하는 방법을 보여주었습니다4; 그러나, 그러한 연구에서 보여지는 몇몇 성분들은 현재 상업적으로 입수가능하지 않다. 또한 기존의 WBP는 습도 및 온도 5,6을 기반으로 한 복잡한 데이터 수집 및 데이터 처리가 필요합니다. 따라서 매일 실온/습도로 보정되는 단순화된 WBP 장치를 개발하고 피험자 자체의 온도/습도 기여도가 측정된 호흡량에 영향을 미치는지 여부를 평가하기로 결정했습니다. 따라서, 현재 이용가능한 물질을 소싱하는 변형된 sWBP 장치가 생성되었다. 또한, 이 실험실 공급 장치가 마우스에서 치명적인 호흡기 멜리오이드증 모델 동안 질병 진행과 관련된 호흡의 변화를 감지할 수 있는지 여부가 조사되었습니다.

이 작업을 위해 구성된 sWBP 장치는 상용 장비 및 소프트웨어를 사용하여 아날로그 압력 센서 데이터를 디지털 판독 값으로 처리했습니다. 압력 센서는 격벽 커넥터가 있는 밀폐된 유리병에 장착되었습니다. 유리 병의 장점은 재료의 구조적 강성으로, 항아리의 내부 압력 변화에 저항하여 호흡 모니터링 중 부피 변화 측정에 영향을 미칩니다. 샘플링 챔버는 정사각형 용기의 두 개의 평평한 표면에 두 개의 포트를 갖도록 설계되었으며, 하나는 교정을 위해 Luer 커넥터로 챔버에 액세스하고 다른 하나는 압력 센서를 수용합니다. 선택한 압력 센서에는 작은 압력 변화(25mbar 범위)를 가진 고감도 게이지 압력 변환기가 있습니다.

이 프로토콜은 호흡기 멜리오이드증의 쥐 모델을 사용하여 입증됩니다. Burkholderia pseudomallei (Bp)는 세계의 열대 지역과 관련된 질병 인 멜리오이드증의 박테리아 제제입니다7. Bp는 환경, 특히 고인 물과 습한 토양의 습한 환경에서 발견되며, 일반적으로 민감한 숙주의 상처 / 긁힘의 피하 감염을 유발합니다. 그러나 Bp는 흡입시 전염성이 있으며 에어로졸 분산에 의한 생물 테러에 사용될 수있는 잠재적 인 위협입니다. 완전 독성 Bp는 BSL-3 실험실에서 취급해야 하지만, 캡슐 돌연변이 균주는 이전에 설계되어 BSL-2에서 안전하게 취급할 수 있고 선택 제제 기준8에서 제외될 수 있습니다. 또한, Bp 5,9의 호흡기 질환 진행을 연구하기 위해 호흡기 멜리오이드증의 삽관 매개 기관내 (IMIT) 감염 모델이 개발되었다. 우리는이 감염 모델을 사용하여 병종 종점을 통해 질병이 진행되는 동안 발생하는 호흡의 변화를 특성화했습니다.

Protocol

여기에 설명 된 절차는 루이빌 대학교 기관 생물 안전위원회 (프로토콜 # 14-038) 및 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 # 19567)에서 검토하고 승인했습니다. 1. 샘플링 챔버의 조립 95mm 개스킷과 밀폐 뚜껑이 있는 600mL 정사각형 유리 넓은 입구 메이슨 통조림 용기의 평평한 표면에 드릴 프레스에 3/4″ 다이아몬드 드릴 비트를 사용하여 두 개의 구멍을 만들고 보석 및 방아쇠 클램프 뚜껑을 만듭니다(그림 1).알림: 샘플링 챔버는 상업적으로 이용 가능하지 않으며 건설해야 합니다. 밀폐 밀봉을 보장하기 위해 격벽과 유리 사이의 접촉면에 고무 와셔(3/4″ 내경, 1″ 외경)를 사용하여 메이슨 용기의 양쪽 구멍을 통해 황동 격벽(1/4″ NPT 내부 나사산, 3/4-16 UNF 외부 나사산)을 조립합니다. 압력 센서에 하나의 벌크헤드 어셈블리를 사용하고 교정을 위해 Luer 연결 주사기로 다른 벌크헤드를 부착합니다.압력 센서의 경우 고성능 게이지 압력 변환기의 1/4″ NPT 나사산을 테프론 테이프로 감싸고 벌크헤드에 끼웁니다. 상용 고품질 데이터 수집 장치와의 인터페이스에 대한 제조업체 배선 지침을 사용하여 납땜 인두를 사용하여 압력 센서 배선을 8핀 수 DIN 커넥터에 연결합니다( 재료 표 참조).참고: 이를 위해서는 DIN 커넥터 배선 내에 150K ohm 1/8W 1% 금속 필름 저항기를 사용해야 합니다. 보정 포트의 경우 1/4″ 수 NPT – 1/8″ 암 NPT 어댑터를 사용하여 1/8″ 수 NPT를 암 루어 잠금 니켈 도금 커넥터에 테프론 테이프로 나사산 연결을 감싸는 황동 벌크헤드에 연결합니다. 사용하지 않을 때는 폴리프로필렌 나사산 수 Luer 캡을 사용하여 Luer 커넥터를 밀봉하십시오.알림: 유리병에 벌크헤드 커넥터를 과도하게 조이면 균열이 발생할 수 있으므로 사용하지 마십시오. 원하는 경우 실리콘 을 고무 가스켓에 추가하여 유리 병에 격벽이 밀폐되도록 할 수 있습니다. 2. 시스템 설정 제조업체의 지침에 따라 8핀 DIN 커넥터를 사용하여 샘플링 챔버를 브리지 증폭기에 연결하고 브리지 증폭기를 데이터 수집 장치에 연결합니다. 데이터 수집 디바이스를 전원 공급 장치와 제조업체의 케이블을 사용하여 생리학적 데이터 분석 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터에 연결합니다.알림: 센서가 측정을 안정화할 수 있도록 사용하기 전에 데이터 수집 장치의 전원이 켜져 있고 최소 5분 동안 예열되었는지 확인하십시오. 데이터 수집 시스템과 인터페이스하기 위해 소프트웨어를 시작합니다. 소프트웨어 내에서 폐 활량 측정 모듈 (옵션)을 다운로드하고 폐활량 측정 > 설정 창에서 기본 단위 설정을 L/s에서 μL/s로 수정합니다. 3. 시스템 교정 소프트웨어 내에서 다음 데이터 창이 있는 4채널 창을 만듭니다: 채널 1: 4k/s 샘플링 속도 및 1mV 범위의 소스 데이터; 채널 2: 고역 통과 1Hz 자동 조정 필터를 사용하는 채널 1의 디지털 필터; 채널 3: 100개 샘플의 평균화에 의한 채널 2 데이터의 평활화 ; 채널 4: 채널 3 데이터의 폐활량 측정 흐름 (사용자 지정 플로우헤드, 공식(μL/s) = 120,000 x 전압으로 보정됨).참고: 120,000은 보정 중에 수정되는 자리 표시자 상관 계수입니다. 다음 열을 사용하여 채널 4의 DataPad 분석을 설정하십시오: 열 1: 채널 4 데이터, 주석 > 전체 주석 텍스트; 열 2: 채널 4 데이터, 평균 순환 주파수 > 순환 측정; 열 3: 채널 4 데이터, 평균 순환 높이> 순환 측정. 차트 표시의 오른쪽 하단 모서리에서 프레임 속도를 100:1로 설정합니다. 이 창 구성을 이후의 모든 연구를 위한 템플릿으로 저장합니다. 샘플 챔버 뚜껑을 닫고 25μL 가스 밀폐 주사기를 Luer 벌크헤드 커넥터에 부착합니다. 20 μL의 부피를 반복적으로 전달하도록 설정된 Chaney 어댑터로 주사기를 맞 춥니 다.알림: 1/16″ 튜빙 및 루어/바브 커넥터의 옵션 짧은 조각을 사용하여 주사기를 샘플 챔버에 연결할 수 있습니다. 그러나 샘플 챔버의 총 공기량이 크게 변경되지 않도록 긴 튜브를 피해야 합니다. Chaney 어댑터의 뎁스 스톱을 사용하여 주사기에 20μL의 공기를 끌어들입니다. 소프트웨어에서 pleth를 0으로 설정하고(설정 > 모든 입력 영점 설정(Alt-Z)) 녹음을 시작합니다. 기록하는 동안 안정적인 베이스라인으로 주사기 플런저를 약 10회 반복하여 측정된 20μL 호흡으로 피사체 호흡을 복제합니다. 녹음을 중지합니다.알림: 인공 호흡의 빈도는 교정의 재현성을 최대화하기 위해 2Hz를 초과해야 합니다. 번호가 매겨진 pleth 기록의 시작을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 측정된 샘플의 ID에 레이블을 지정하고 Add Comment(주석 추가)를 클릭합니다. 주사기를 재설정하고 입력을 영점으로 설정한 다음 20μL 펄스의 기록 측정을 두 번 더 반복합니다(총 3회의 녹음 세션). 모든 측정을 완료한 후, 컴퓨터 마우스를 사용하여 인공 20 μL 호흡을 정확하게 나타내는 호흡 플레스의 일부를 선택한다.참고: DataPad 모듈 내에서 데이터는 미리보기 헤더에 나타나 호흡수(평균 순환 주파수, Hz) 및 호흡 깊이(평균 순환 높이, μL)를 일시적으로 판독합니다. 데이터 미리보기는 DataPad에 추가 아이콘을 사용하여 DataPad에 기록할 수 있습니다. 열 3 데이터(평균 순환 높이)를 검토하고 세 개의 기록에서 측정된 평균 호흡량을 계산합니다. 측정된 평균 호흡량에 대해 다음 계산을 수행합니다: 교정 계수 = 전달된 부피 / 측정된 부피 x 120,000.참고: 120,000은 3.1단계에서 사용된 자리 표시자 유량 헤드 교정 계수였으며 이제 측정된 데이터에서 수정되었습니다. 이제 시스템은 현재 환경 온도 및 습도를 사용하여 일반적인 마우스 호흡으로 보정됩니다. 이제 시스템은 피사체 호흡을 모니터링할 수 있으며 온도/습도의 변동을 고려하여 매일 보정을 다시 수행할 수 있습니다. 4. 주제 모니터링 3.4단계에 설명된 대로 마스터 템플릿을 열거나 4.2-4.3단계를 완료합니다. 소프트웨어 내에서 다음 데이터 처리로 4채널 창을 만듭니다: 채널 1: 4k/s 샘플링 속도 및 1mV 범위의 소스 데이터; 채널 2: 하이 패스 1Hz 자동 조정 필터를 사용하는 채널 1의 디지털 필터; 채널 3: 100개 샘플의 평균화에 의한 채널 2 데이터의 평활화 ; 채널 4: 채널 3 데이터의 폐활량 측정 흐름(사용자 지정 플로우헤드, 공식(μL/s) = 120,000 x 전압으로 보정됨).알림: 120,000은 현재 압력 센서에 대해 계산된 상관 계수입니다. 그러나 사용자는 3단계에서 설명한 시스템 보정을 수행하고 대신 이 사용자 정의 상관 계수를 사용해야 합니다. 다음 열을 사용하여 채널 4의 DataPad 분석을 설정하십시오: 열 1: 채널 4 데이터, 주석 > 전체 주석 텍스트; 열 2: 채널 4 데이터, 평균 순환 주파수 > 순환 측정; 열 3: 채널 4 데이터, 평균 순환 높이> 순환 측정. 피사체를 샘플링 챔버에 넣고 뚜껑을 닫습니다. 이 실험을 위해 의식이 있는 4-12주 암컷 흰둥이 C57BL/6J 마우스(B6(Cg)-Tyrc-2J/J)를 사용했습니다. Luer 격벽 캡을 잠시 풀어 챔버의 대기압을 균등화하고(뚜껑 밀봉에서) 다시 조입니다. 모든 입력을 제로화(Alt-Z 단축키)하고 녹음을 시작하기 전에 피사체가 샘플링 챔버 내에서 활발하게 움직이지 않는지 관찰하십시오.알림: 피사체가 샘플링 챔버에서 움직이기 시작하면 기준선이 스케일에서 벗어날 수 있으며, 이는 녹음 중간에 모든 입력을 다시 영점화하여 해결할 수 있으며, 이는 스케일에 새로운 녹음을 생성합니다. 피험자가 녹음 중에 탐색 또는 몸단장에 참여한다고 가정합니다. 혈량 측정의 어느 부분이 정상적인 호흡을 가장 정확하게 반영하는지 확인하십시오. 번호가 매겨진 pleth 기록의 시작 부분을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 주제의 ID에 레이블을 지정하고 주석 추가를 클릭합니다. 피사체를 케이지로 되돌립니다. 질식과 스트레스를 피하기 위해 밀봉된 샘플링 챔버에서 보내는 시간을 5분으로 제한하십시오.참고: 샘플 챔버의 600mL 공기 부피가 건강한 마우스 호흡에 의해 <15mL/min으로 빠르게 소비되지 않는다는 점을 감안할 때 질식 위험은 낮습니다. 컴퓨터 마우스를 사용하여 피사체 호흡을 정확하게 나타내는 호흡 횟수의 일부를 선택합니다.참고: DataPad 모듈 내에서 데이터는 미리보기 헤더에 나타나 호흡수(평균 순환 주파수, Hz) 및 호흡량(평균 순환 높이, μL)을 일시적으로 판독합니다. 데이터 미리보기는 DataPad에 추가 아이콘을 사용하여 DataPad에 기록할 수 있습니다. 계속해서 대상 마우스를 한 번에 하나씩 측정하고 호흡의 대표 부분을 DataPad에 기록합니다. 데이터 기록 후 DataPad 데이터를 Excel로 내보냅니다. 분 부피를 다음과 같이 계산하십시오 : 분 부피 (mL / 분) = 호흡수 (Hz) x 호흡 부피 (μl) x 0.06.

Representative Results

시스템 캘리브레이션데이터 분석 소프트웨어를 사용하면 여기에 설명된 것과 같은 맞춤형 플로우헤드를 직접 교정할 수 있습니다. 이 작업은 폐활량 측정 흐름을 설정할 때 수행됩니다. 3.1단계에서 설명한 대로 시스템 내에서 전압 대 체적 상관 계수를 계산하는 알려진 교정 풍량을 입력하는 옵션이 있습니다. 그러나 이것은 단일 판독을 기반으로 상관 계수를 생성하며 n = 1 표준에서 교정의 고유 한 변동은 유용성이 좋지 않은 것으로 관찰되었습니다. 현재의 접근 방식은 이러한 단점을 해결할 수 있으며 사용자가 교정 계수를 계산하기 위해 평균화된 여러 판독값을 사용하여 일일 교정을 수행할 수 있도록 합니다. 20 μL의 주입된 공기를 사용한 보정이 본원에서 입증되었으며, 이는 전형적인 마우스에서 전형적인 고급 호흡량을 나타냅니다. 소프트웨어는 원점 절편(0,0)을 가정하므로 이 접근 방식을 사용하여 0-20μL에서 보정됩니다. sWBP에 대해 여기에서 제안된 방법론은 매일 보정하므로 환경 습도/온도의 변동을 고려합니다. 특정 WBP에 사용 된 원래 방법은 인간 유아의 환기 측정을위한 WBP를 개발 한 1955 년 Drorbaugh와 Fenn의 방법론으로 거슬러 올라갑니다5. Drorbaugh와 Fenn 계산은 환경과 피사체의 온도와 습도의 변화를 설명합니다. 현재 접근 방식은 각 sWBP 세션을 보정하여 환경 변동을 수정합니다. 그럼에도 불구하고 마우스의 비강 / 폐를 가로 지르는 호흡의 가열 및 가습이 알려진 공기량의 측정에 영향을 미치는지 여부를 다루기로 결정했습니다. 따라서, 가열 및 가습 보정 된 공기 측정에 대한 피험자의 효과를 모방하기 위해 인공 장치가 만들어졌습니다. Luer 커넥터를 15mL 원뿔형 튜브에 부착하고 이 밀봉된 원뿔형 인라인을 샘플 챔버와 기밀 교정 주사기 사이에 배치했습니다. 20 μL 교정은 실온(23°C)에서 유지되는 빈 원추형 튜브를 사용하여 수행되었습니다. 그런 다음 원추형 튜브를 Luer 커넥터 바로 아래에 증류수로 부분적으로 채워 원추형의 헤드 스페이스를 평형을 이루는 시간을 허용했습니다. 그런 다음 습도의 영향을 조사하기 위해 보정 부피를 다시 측정했습니다. 원뿔형 튜브를 가열 블록에 넣고 습한 환경에서 37 ° C에서 평형을 이루고 최종적으로 물 없이 37 °C로 평형화하여 주제 가열의 효과를 평가하고 습도의 추가 기여 없이 평형화했습니다. 그림 2 는 테스트된 모든 조건이 기밀 주사기로 전달된 보정된 20μL 측정에 큰 영향을 미치지 않았음을 보여줍니다. 이 발견으로부터, sWBP는 측정된 호흡량에 큰 영향을 미치지 않기 때문에 동물 대상의 온도와 습도에 근거한 복잡한 계산 없이 연구 동물의 호흡을 모니터링하는 접근 가능한 접근 방식을 제공한다는 결론을 내렸습니다. 피사체 모니터링sWBP는 박테리아 병원체 B. 슈도말레이에 의한 치명적인 호흡기 감염의 질병 동안 호흡을 모니터링하기 위해 사용되었다. 의식이 있는 동물의 호흡을 모니터링하는 한 가지 과제는 샘플 챔버 내에서 움직이는 정상적인 건강한 동물의 호기심입니다. 마우스의 움직임은 측정 전에 수일에 걸쳐 피험자를 챔버로 예비컨디셔닝함으로써 부분적으로 완화될 수 있는 지속적으로 움직이는 기준선을 생성한다. 이 문제는 주로 건강한 마우스의 기준선 측정에 영향을 미치는데, 이는 피험자가 감염 중에 무기력해지기 때문에 피험자가 감소된 피험자 활동으로 sWBP를 훨씬 더 관리하기 쉽게 만듭니다. 신체적이든 마취이든 어떤 형태의 구속을 시도하려는 유혹이있을 수 있습니다. 신체적 구속의 사용은 스트레스를 유발하여 자연 호흡에 영향을 줄 수 있습니다. 또한, 마취제의 사용은 호흡수 및 깊이10에 현저한 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 사내 sWBP 장치를 사용한 마취의 영향을 조사하기로 결정했습니다. 이소플루란은 감염 모델 동안 생체내 진단 영상화를 수행하는 데 일반적으로 사용되므로 C57BL/6 마우스를 마취시키고 sWBP를 사용하여 마취에서 회복될 때까지 진행을 모니터링했습니다. 이 시험은 마취 후 회복 기간을 연장하기 위해 4주 된 어린 알비노 C57BL/6J 마우스로 수행되었습니다. 도 3 은 바람직한 마취제가 마우스로 하여금 큰 조석 부피의 공기와 함께 느린 호흡 속도를 나타내게 한다는 것을 보여준다. 쥐가 진정 작용에서 회복되기 시작하면 호흡수가 증가하고 호흡량이 감소하여 총 흡기 공기가 천천히 증가하는 순 효과가 있습니다. 이 시험에서 호흡량은 회복 후 처음 30초 이내에 마취 전 수준으로 회복되는 것으로 나타났습니다. 호흡수는 마취에서 제거한 후 기준선 호흡이 2-2.5분으로 회복될 때까지 꾸준히 증가합니다. 분 부피는 호흡수의 효과를 밀접하게 따랐으며, 마취에서 제거한 후 2.5 분까지 기준선 분 부피에 도달했습니다. 이 발견은 sWBP 접근법에서 마취를 사용해서는 안된다는 것을 뒷받침합니다. 마취가 숙주 대사를 늦추고 흡기 산소에 대한 수요를 감소시키기 때문에 기준 호흡에 극적인 영향을 미칩니다. 샘플 챔버의 위생은 연구 별 감염 통제뿐만 아니라 피험자 간의 스트레스에 영향을 줄 수있는 소변이나 대변의 페로몬의 영향을 해결하기 위해 피험자간에 고려되어야합니다. WBP는 호흡기 질환 모델에서 폐 기능을 비침습적 방식으로 모니터링하기 위한 매력적인 전략입니다. sWBP는 치명적인 호흡기 멜리오이드증 감염 (그림 4) 동안 호흡이 어떻게 변하는지 연구하는 데 사용되었으며, 시점은 폐의 생물 발광 모니터링을 반영합니다. 이 모델은 혼수의 조기 발병과 관련이 있으며, 이는 감염 후 약 3 일에 빈사 상태의 질병이 발생할 때까지 천천히 진행되는 방식으로 지속됩니다. 또한 마우스의 호흡률과 총 흡기 공기 (분 부피)가 감염 첫날에 급격히 감소하고 나머지 감염 과정 동안 낮게 유지되는 것으로 관찰되었습니다 (그림 4A, C). 이 패턴은 감염의 다음 2 일 동안 지속되는 조기 발병 혼수 상태와 일치합니다. 대조적으로, 호흡량은 처음 24 시간 동안 가파르게 떨어지지 않고 대신 약간이고 꾸준한 감소를 보이며 질병의 3 일 동안 선형 감소에 접근합니다 (그림 4B). 그림 1: sWBP 장치. 맞춤형 샘플 챔버는 두 개의 평평한 면에 격벽 커넥터가 있는 밀봉 가능한 정사각형 유리 병으로 구성되었습니다. 하나의 벌크헤드는 8핀 DIN 연결을 통해 브리지 증폭기 및 데이터 수집 디바이스 디지타이저에 연결된 게이지 압력 센서를 장착하는 데 사용되었습니다. 두 번째 격벽에는 기밀 주사기로 교정하기 위해 Luer 커넥터가 장착되었습니다. 장치가 소프트웨어를 실행하는 PC에 연결되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: 피사체 온도와 습도가 호흡량에 미치는 영향. Luer 커넥터가 있는 15mL 원뿔형 튜브를 20μL 교정 주사기와 샘플 챔버 사이에 인라인으로 설치했습니다. 시스템은 원뿔형 튜브의 추가 온도/습도 기여 없이 20μL로 보정되었습니다. 다른 측정은 증류수로부터 포화 습도로 평형화 및/또는 실온(23°C)에서 체온(37°C)까지 원뿔형 튜브의 온난화로 수집되었습니다. Tukey의 다중 비교 사후 테스트를 사용한 일원 분산 분석에 의한 각 조건의 n = 5 측정에서 유의 한 차이가 발견되지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: 가스 마취가 생쥐의 호흡에 미치는 영향. 4주령의 암컷 알비노 C57BL/6J 마우스(8.6g)의 대표 데이터를 산소 중 3% 이소플루란으로 5분 동안 진정시키고 sWBP 샘플 챔버로 옮겼습니다. Pleth 데이터는 마취에서 제거한 후 150 초 동안 수집되었습니다. 피험자는 마취에서 제거한 후 100 초까지 초기 보행을 시작했습니다. (A) 마취 전 기준선 호흡, 4.97Hz 호흡률, 9.74μL 호흡량, 및 2.91mL분 부피를 측정합니다. (B) 마취에서 회복하는 동안 호흡에 대한 변화의 처음 60 초. (A-B) 호흡당 μL를 측정하는 수직축과 초 단위로 수평축을 측정합니다. (씨-에) 환기 데이터는 마취에서 회복되는 150초 동안 수집되었으며, (C) 호흡수, (D) 호흡량 및 (E) 계산된 분 부피에 대해 시점당 ≥3회의 호흡 주기에서 평균되었습니다. 마취 전 기준선 값은 각 그래프에서 수평 점선으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: 호흡기 멜리오이드증이 숙주 호흡에 미치는 영향. 5마리의 8주 암컷 C57BL/6 마우스를 생물발광 B. 슈도말라이 균주 JW270의 4.9 log CFU로 감염시켰다. sWBP는 3일간의 감염 과정에 걸쳐 실시되었으며, 호흡수(A) 및 호흡량(B)을 측정하였다. 총 흡기 공기는 분 부피(C)로 계산되었습니다. 5개 피험자 각각에 대한 데이터는 3차 다항식 회귀 분석으로 독립적으로 플로팅됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

sWBP는 작은 동물 모델에서 호흡기 감염에 대한 이해를 높이기 위한 매력적인 접근법이다. 중요한 것은 비침습적 접근 방식이므로 감염 문제 동안 연구 동물에게 과도한 스트레스를 유발할 심각한 위험을 초래하지 않는다는 것입니다. 실제로, 피험자 호흡을 모니터링하는 절차는 몇 분 및 최소한의 피험자 취급을 요구하는 신속한 테스트이다. 과학적 이점은 미생물 병원체가 질병 중 폐 기능에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 고해상도 이해입니다. 이 접근법은 기초 연구에 이점을 제공하여 병원체가 어떻게 질병을 유발하는지에 대한 이해를 촉진하고 새로운 치료법이 연구 대상을 호흡기 건강 상태로 회복시키는 방법을 이해하는 번역 유용성을 제공합니다.

이 원고에서는 초기 무기력 반응을 일으키는 병원체 B. pseudomallei에 대한 대표적인 결과가 제공됩니다. 모든 세균성 폐 감염이 마우스 감염 모델에서 동일한 방식으로 존재하는 것은 아닙니다. 다른 감염 모델에 대한 이전 경험에 따르면 박테리아 병원체 Klebsiella pneumoniae는 마우스가 감염에 굴복하는 지점까지, 또한 감염 후 약 3일째에 무증상 감염으로 나타납니다.11. 영감을받은 공기에 대한 숙주 수요 (즉, 미세한 부피)는 주어진 질병이 나타내는 혼수 상태의 정도와 밀접한 관련이있을 수 있다고 가정합니다. 다양한 박테리아 병원체가 호흡기 질환 중 폐 기능에 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위해서는 향후 연구가 필요할 것입니다. 상이한 병원체는 (1) 세포 내 또는 세포 외 병원체가 되는 성향, (2) 조기/후기 저체온 반응을 일으키는 능력, (3) 독성 결정 인자의 상이한 레퍼토리의 사용을 포함하여 숙주 방어를 회피하는 독특한 접근법을 갖는 것으로 이해된다 3,12,13. 따라서 다른 질병 전략은 감염 중 폐 기능과 호흡에 독특한 영향을 미칠 가능성이 있습니다.

이 프로토콜에 설명된 권장 설정은 sWBP 중에 존재하는 고유한 문제를 수용하도록 수정할 수 있습니다. sWBP 기록 세션 중에 경험하는 일반적인 문제 중 하나는 샘플 챔버 내에서 피험자의 움직임입니다. 언급했듯이 이 움직임은 기준선을 수정하고 호흡 측정의 정확도에 영향을 줄 수 있습니다. 디지털 필터를 사용하여 변속 기준선을 정규화하여 작은 움직임에도 불구하고 실행 가능한 호흡 측정이 가능했습니다. 과도한 이동은 기준 측정값을 0으로 설정된 입력 범위를 벗어날 수 있습니다. 녹화는 1mV 범위(채널 1 설정)에서 권장되며, 이는 범위 밖의 데이터 손실을 방지하면서 혈량 측정의 피크를 계속 관찰하는 절충안을 제공합니다. 예외적으로 활동적인 피사체의 경우 범위를 벗어난 지속적인 신호를 피하기 위해 기록 범위를 >1mV로 확장해야 할 수 있습니다.

권장 절차에서는 환경 습도/온도 변동을 수용하기 위해 매일(또는 각 세션에서) 교정해야 합니다. 전통적인 WBP는 환경과 피사체 5,6의 온도/습도를 고려한 복잡한 계산을 사용합니다. 본 sWBP 장치에서, 호스트 온도/습도의 영향은 교정 소스의 측정된 호흡량을 유의하게 변화시키지 않는다는 것이 입증되었다. 따라서 sWBP의 이러한 접근 방식은 Drorbaugh와 Fenn의 >50년 된 접근 방식과 근본적으로 다릅니다. 여기서 sWBP는 호스트의 추가 보정 없이 압력 변화를 측정된 호흡량과 직접 관련시킵니다.

연구 동물 WBP와 임상 WBP를 대조하는 것이 필수적입니다. sWBP에 의해 수집하려고 시도된 생체 인식 데이터의 유형은 호흡량과 빈도입니다. 이러한 측정은 환자가 호흡 모니터를 입에 대고 공기 흐름을 모니터링하는 장치에 정상적으로 호흡하는 간단한 폐활량 측정 장비를 사용하여 임상 적으로 수집됩니다. 연구 동물의 유사한 폐활량 측정은 구속이 필요하므로 스트레스와 호흡의 고유 한 장애에 기여합니다. 따라서 단순 폐활량 측정은 임상적으로 기능적이지만 연구 동물에게는 그렇지 않습니다. WBP는 잔류 폐 부피와 같은 측정을 포함하여 고급 데이터를 수집하는 클리닉에서 필수적인 목적을 수행합니다. 이러한 데이터는 강제 만료(깊은 숨을 내쉬어 폐를 비우는 것)를 포함하여 호흡하는 방법에 대한 지침을 따를 수 있는 피험자의 맥락에서만 포함될 수 있습니다. 연구 동물은 연구원의 호흡 지시를 따를 수 없습니다. WBP 동안 임상적으로 수집된 많은 고급 측정은 연구 동물에서 재현할 수 없습니다. 연구 동물에서의 WBP는 임상 WBP와 근본적으로 다르다. 동물 WBP는 동물의 스트레스와 호흡 섭동을 피하기 위해 제한되지 않은 방식으로 간단한 환기 데이터 (호흡수 및 부피)를 수집하려고합니다. 지금까지, 연구 동물에서 WBP의 사용은 환경 및 피험자의 온도 및 습도에 기초한 복잡한 계산을 포함하여, 임상 WBP에서 사용되는 기술을 복제하는 것으로 보이지만, 강제 호기화를 수행하는 방법에 대한 지시를 따를 수 있는 대상체로부터 고급 데이터를 수집할 수 있는 능력은 없다. 이를 염두에두고 WBP의 단순화 된 버전이 호흡기 질환 연구와 관련된 적절한 호흡 빈도와 부피를 수집하기에 충분한지 여부를 입증하고자했습니다. 환경 온도 및 습도의 변화를 보상하는 보정 세션이 사용되었습니다. 또한, 측정된 호흡량에 대한 온도 및 습도가 호흡량을 정확하게 측정하는데 큰 영향을 미치지 않는다는 것이 인공 마우스로 입증되었다. sWBP는 사용자가 번거로운 수학적 데이터 처리를 사용할 필요 없이 동물 연구 연구에 탁월한 응용 프로그램을 가지고 있다고 결론지었습니다.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 국립 보건원 COBRE 보조금 P20GM125504-01 하위 프로젝트 8246의 지원을 받았습니다.

Materials

1/8" NPT Luer adaptor Amazon B07DH9MY8W Calibration port
1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor Amazon B07T6CR6FS Bulkhead to luer adaptor
150 kohm resistor Amazon B07GPRYL81 Pressure transducer excitation voltage selection
3/4" diamond drill bit Drilax DRILAX100425 To drill bulkhead mounts in glass jar
Bridge Amp AD Instruments FE221 One channel option
Bulkhead fitting Legines 3000L-B 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling
Chaney adaptor Hamilton 14725 Gas tight syringe adaptor for set volume
DIN connector AD Instruments SP0104 To connect pressure sensor to Bridge Amp
Gastight syringe, 25 uL Hamilton 80201 Calibration syringe
LabChart AD Instruments Life Science Data Acquisition Software
Luer plug Cole Parmer 45513-56 Calibration port closure
PowerLab 4/26 AD Instruments PL2604 Digital interface to computer
Pressure transducer Omega Engineering PX409-10WGV High accuracy oil filed gage pressure sensor
Rubber gasket Amazon B07LH4C8LS To mount bulkheads (4 required per chamber)
Square glass jar Amazon B07VNSPR8P 600 ml with 95 mm silicone gasket
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Warawa, J. M., Long, D., Rosenke, R., Gardner, D., Gherardini, F. C. Role for the Burkholderia pseudomallei capsular polysaccharide encoded by the wcb operon in acute disseminated melioidosis. Infection and Immunity. 77 (12), 5252-5261 (2009).
  2. West, T. E., Myers, N. D., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Murine pulmonary infection and inflammation induced by inhalation of Burkholderia pseudomallei. International Journal of Experimental Pathology. 93 (6), 421-428 (2012).
  3. Lawrenz, M. B., et al. Development and evaluation of murine lung-specific disease models for Pseudomonas aeruginosa applicable to therapeutic testing. Pathogens and Disease. 73 (5), (2015).
  4. Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51755 (2014).
  5. Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
  6. Simon, G., Pride, N. B., Jones, N. L., Raimondi, A. C. Relation between abnormalities in the chest radiograph and changes in pulmonary function in chronic bronchitis and emphysema. Thorax. 28 (1), 15-23 (1973).
  7. Gassiep, I., Armstrong, M., Norton, R. Human melioidosis. Clinical Microbiology Reviews. 33 (2), 06-19 (2020).
  8. Gutierrez, M. G., Warawa, J. M. Attenuation of a select agent-excluded Burkholderia pseudomallei capsule mutant in hamsters. Acta Tropica. 157, 68-72 (2016).
  9. Gutierrez, M. G., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. Type 3 secretion system cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (1), 3441 (2015).
  10. Rocco, P. R. M., Zin, W. A., Gullo, A. . Anaesthesia, Pain, Intensive Care and Emergency Medicine. , (2002).
  11. Fodah, R. A., et al. Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model. PLoS One. 9 (9), 107394 (2014).
  12. Gotts, J. E., et al. Clinically relevant model of pneumococcal pneumonia, ARDS, and nonpulmonary organ dysfunction in mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (5), 717-736 (2019).
  13. Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host & Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).

Tags

Simplified Whole Body PlethysmographyLung FunctionRespiratory MelioidosisNon-restrained AnimalsSpirometryData AcquisitionCalibrationData AnalysisCyclic MeasurementsPlethysmography

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Olson, J. M., Warawa, J. M. Simplified Whole Body Plethysmography to Characterize Lung Function During Respiratory Melioidosis. J. Vis. Exp. (192), e62722, doi:10.3791/62722 (2023).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image