Pletismografia semplificata di tutto il corpo per caratterizzare la funzione polmonare durante la melioidosi respiratoria

Calibrazione del sistemaIl software di analisi dei dati consente la calibrazione diretta di una testa di flusso personalizzata, come quella qui descritta. Questo viene eseguito quando si imposta il flusso spirometrico. Come descritto al punto 3.1, esiste un’opzione per immettere il volume d’aria di calibrazione noto, che calcola il coefficiente di correlazione tensione-volume all’interno del sistema. Questo, tuttavia, genera un coefficiente di correlazione basato su una singola lettura, ed è stato osservato che la variazione intrinseca della calibrazione da uno standard n = 1 ha scarsa utilità. L’approccio attuale può ovviare a questa lacuna e consente a un utente di eseguire una calibrazione giornaliera utilizzando più letture mediate per calcolare un coefficiente di calibrazione. Qui è stata dimostrata la calibrazione con 20 μL di aria iniettata, che rappresenta un tipico volume di respiro di fascia alta in un mouse tipico. Il software assume un’intercetta di origine (0,0) ed è quindi calibrato da 0-20 μL utilizzando questo approccio. La metodologia qui proposta per sWBP si calibra quotidianamente, tenendo così conto di eventuali fluttuazioni di umidità/temperatura ambientale. I metodi originali utilizzati per la WBP specifica, risalgono alla metodologia di Drorbaugh e Fenn del 1955, che hanno sviluppato WBP per misurare la ventilazione nei neonati umani5. I calcoli di Drorbaugh e Fenn tengono conto delle variazioni di temperatura e umidità dell’ambiente e del soggetto. L’approccio attuale corregge le fluttuazioni ambientali calibrando ogni sessione sWBP. Tuttavia, è stato deciso di affrontare se il riscaldamento e l’umidificazione della respirazione attraverso la cavità nasale / polmone di un topo influenzano la misurazione di un volume d’aria noto. Pertanto, è stato creato un apparato artificiale per imitare l’effetto del soggetto sul riscaldamento e sull’umidificazione delle misurazioni calibrate dell’aria. I connettori Luer sono stati collegati a un tubo conico da 15 mL e hanno posizionato questo conico sigillato in linea tra la camera del campione e la siringa di calibrazione a tenuta di gas. È stata eseguita una taratura di 20 μL utilizzando un tubo conico vuoto tenuto a temperatura ambiente (23 °C). Il tubo conico è stato quindi parzialmente riempito con acqua distillata appena sotto i connettori Luer, consentendo il tempo di equilibrare lo spazio di testa del conico; Il volume di calibrazione è stato quindi rimisurato per studiare l’effetto dell’umidità. Il tubo conico è stato posto in un blocco riscaldante e bilanciato a 37 °C in ambiente umido, e infine equilibrato a 37 °C senza acqua per valutare l’effetto del riscaldamento soggetto e senza alcun apporto aggiuntivo di umidità. La figura 2 dimostra che tutte le condizioni testate non hanno avuto un impatto significativo sulla misurazione calibrata di 20 μL fornita dalla siringa a tenuta di gas. Da questa scoperta, si è concluso che sWBP offre un approccio accessibile per monitorare la respirazione negli animali da ricerca senza la necessità di calcoli complessi basati sulla temperatura e l’umidità del soggetto animale, in quanto questi non hanno alcun impatto significativo sul volume del respiro misurato. Monitoraggio dei soggettisWBP è stato utilizzato per monitorare la respirazione durante la malattia delle infezioni respiratorie letali con il patogeno batterico B. pseudomallei. Una sfida del monitoraggio della respirazione negli animali coscienti è la curiosità di animali sani normali che si muovono all’interno della camera del campione. Il movimento del mouse crea una linea di base in costante movimento che può essere mitigata in parte pre-condizionando i soggetti alla camera per un periodo di diversi giorni prima della misurazione. Questo problema riguarda principalmente la misurazione basale nei topi sani, poiché i soggetti diventano letargici durante l’infezione, rendendo la sWBP molto più gestibile con una ridotta attività del soggetto. Potrebbe essere allettante tentare di usare una qualche forma di contenzione, sia fisica che anestesia. L’uso della contenzione fisica può influenzare la respirazione naturale causando stress. Inoltre, l’uso di anestetici è noto per avere effetti pronunciati sulla frequenza respiratoria e sulla profondità10; pertanto, è stato deciso di studiare l’impatto dell’anestesia con l’apparato sWBP interno. L’isoflurano è comunemente usato per eseguire l’imaging diagnostico in vivo durante i modelli di infezione e, pertanto, un topo C57BL / 6 è stato anestetizzato e monitorato la progressione fino al recupero dall’anestesia utilizzando sWBP. Questo studio è stato condotto con un topo albino C57BL/6J di 4 settimane per prolungare la finestra di recupero dall’anestesia. La Figura 3 dimostra che l’anestetico preferito fa sì che i topi mostrino una frequenza respiratoria lenta con un grande volume d’aria. Quando i topi iniziano a riprendersi dalla sedazione, la loro frequenza respiratoria aumenta e il volume del respiro diminuisce, con l’effetto netto che l’aria totale inspirata aumenta lentamente. In questo studio, è stato riscontrato che il volume del respiro viene ripristinato ai livelli pre-anestesia entro i primi 30 secondi di recupero. La frequenza respiratoria aumenta costantemente fino a quando la respirazione basale viene ripristinata a 2-2,5 minuti dopo la rimozione dall’anestesia. Il volume minuto ha seguito da vicino gli effetti della frequenza respiratoria, raggiungendo il volume minuto basale di 2,5 minuti dopo la rimozione dall’anestesia. Questa scoperta supporta che l’anestesia non dovrebbe essere impiegata nell’approccio sWBP. Influisce drammaticamente sulla respirazione di base, non sorprendentemente, poiché l’anestesia rallenterà il metabolismo dell’ospite, creando una ridotta domanda di ossigeno ispirato. L’igienizzazione della camera del campione deve essere presa in considerazione anche tra i soggetti per affrontare il controllo delle infezioni specifiche dello studio, nonché l’impatto dei feromoni da urina o feci che potrebbero influire sullo stress tra i soggetti. La WBP è una strategia interessante per monitorare la funzione polmonare nei modelli di malattie respiratorie in modo non invasivo. sWBP è stato utilizzato per studiare come la respirazione cambia durante le infezioni letali da melioidosi respiratoria (Figura 4), con punti temporali che rispecchiano il monitoraggio della bioluminescenza nel polmone. È stato osservato che questo modello è associato a un esordio precoce di letargia, che persiste in modo lentamente progressivo fino allo sviluppo della malattia moribonda a circa 3 giorni dopo l’infezione. È stato anche osservato che la frequenza respiratoria e l’aria totale inspirata (volume minuto) dei topi diminuiscono rapidamente durante il primo giorno di infezione e rimangono bassi per il resto del decorso dell’infezione (Figura 4A, C). Questo modello è coerente con la letargia ad esordio precoce, che persiste per i prossimi 2 giorni dell’infezione. Al contrario, il volume del respiro non diminuisce bruscamente durante le prime 24 ore e invece ha una leggera e costante diminuzione, che si avvicina a un declino lineare nel corso dei 3 giorni della malattia (Figura 4B). Figura 1: apparato sWBP. Una camera di campionamento personalizzata è stata costruita da un barattolo di vetro quadrato sigillabile con connettori per paratia su due facce piatte. Una paratia è stata utilizzata per montare un sensore di pressione manometrico collegato a un amplificatore a ponte e un digitalizzatore di dispositivi di acquisizione dati tramite una connessione DIN a 8 pin. La seconda paratia era dotata di un connettore Luer per la calibrazione mediante una siringa a tenuta di gas. Il dispositivo era collegato a un PC su cui era in esecuzione il software. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 2: Effetto della temperatura e dell’umidità del soggetto sul volume del respiro. Un tubo conico da 15 mL con connettori Luer è stato installato in linea tra la siringa di calibrazione da 20 μL e la camera di campionamento. Il sistema è stato calibrato a 20 μL senza alcun contributo aggiuntivo di temperatura/umidità dal tubo conico. Altre misurazioni sono state raccolte dopo l’equilibratura con umidità satura da acqua distillata e/o riscaldamento del tubo conico dalla temperatura ambiente (23 °C) alla temperatura corporea (37 °C). Nessuna differenza significativa è stata rilevata da n = 5 misurazioni di ciascuna condizione da One-way ANOVA con il confronto multiplo di Tukey post-test. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 3: Effetto dell’anestesia gassosa sulla respirazione nei topi. I dati rappresentativi di una femmina di topo albino C57BL/6J di 4 settimane (8,6 g) sono stati sedati per 5 minuti con isoflurano al 3% in ossigeno e trasferiti in una camera di campionamento sWBP. I dati di Pleth sono stati raccolti per 150 secondi dopo la rimozione dall’anestesia. Il soggetto ha iniziato la deambulazione iniziale da 100 secondi dopo la rimozione dall’anestesia. (A) Respirazione basale prima dell’anestesia, che misura una frequenza respiratoria di 4,97 Hz, un volume di respiro di 9,74 μL e un volume minuto di 2,91 ml. (B) I primi 60 s di modifiche alla respirazione durante il recupero dall’anestesia. (A-B) Asse verticale che misura μL per respiro e asse orizzontale in secondi. (C-E) I dati sulla ventilazione sono stati raccolti durante i 150 s di recupero dall’anestesia, in media da ≥3 cicli di respiro per punto temporale per (C) frequenza respiratoria, (D) volume del respiro e (E) volume minuto calcolato. I valori basali pre-anestesia sono indicati con una linea tratteggiata orizzontale in ciascun rispettivo grafico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 4: Effetto della melioidosi respiratoria sulla respirazione dell’ospite. Cinque topi femmina C57BL/6 di 8 settimane sono stati infettati con 4,9 log CFU di B. pseudomallei ceppo bioluminescente JW270. sWBP è stato condotto durante il corso di 3 giorni dell’infezione, misurando la frequenza respiratoria (A) e il volume del respiro (B). L’aria totale inspirata è stata calcolata come volume minuto (C). I dati per ciascuno dei cinque soggetti sono tracciati in modo indipendente con regressione polinomiale del terzo ordine. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.