تخطيط التحجم المبسط لكامل الجسم لتوصيف وظائف الرئة أثناء داء الميليويد التنفسي
Summary
يقدم هذا البروتوكول بناء واستخدام جهاز مبسط لتخطيط التحجم لكامل الجسم لمراقبة تطور أمراض الجهاز التنفسي البكتيرية بشكل غير جراحي.
Abstract
تخضع النماذج الحيوانية البديلة للمرض ل 3Rs من البحوث المسؤولة. هناك إعادة النظر بشكل متكرر في التحسينات على النماذج الحيوانية لضمان تقدم كل من رعاية الحيوان والرؤى العلمية مع توافر التقنيات الجديدة. توضح هذه المقالة استخدام تخطيط التحجم المبسط لكامل الجسم (sWBP) لدراسة فشل الجهاز التنفسي بشكل غير جراحي في نموذج من داء الميليويد التنفسي المميت. لدى sWBP حساسية للكشف عن التنفس في الفئران خلال مسار المرض بأكمله ، مما يسمح بقياس الأعراض المرتبطة بالموت (بطء التنفس ونقص التنفس) وربما استخدامها لتطوير معايير نقطة النهاية الإنسانية.
بعض فوائد sWBP في سياق أمراض الجهاز التنفسي هي أن مراقبة التنفس المضيف تأتي الأقرب من أي قياس فسيولوجي في تقييم الخلل الوظيفي في الأنسجة المصابة الأولية ، أي الرئة. بالإضافة إلى الأهمية البيولوجية ، فإن استخدام sWBP سريع وغير جراحي ، مما يقلل من الإجهاد في البحث. يوضح هذا العمل استخدام جهاز sWBP الداخلي لمراقبة المرض طوال فترة فشل الجهاز التنفسي في نموذج الفئران من داء الميليويد التنفسي.
Introduction
غالبا ما ترتبط مسببات الأمراض البكتيرية التنفسية باستجابة التهابية في الرئة تؤدي إلى أمراض الرئة 1,2. في البيئة السريرية ، يتضمن تشخيص الالتهاب الرئوي عادة تقنيات المزرعة من البلغم ، وتحليل تشبع الدم بالأكسجين ، والأشعة السينية للصدر. يمكن ترجمة هذه التقنيات لنماذج عدوى الحيوانات الصغيرة ، ولكن تحليل تشبع الأكسجين فقط يمثل تحليلا سريعا في الوقت الفعلي في الفئران لشدة المرض. تم التحقيق سابقا في تشبع الأكسجين في الدم (SpO2) كوسيلة لتتبع تطور المرض في دراسات أمراض الجهاز التنفسي. ومع ذلك ، فإن الفئران المحتضرة لديها قراءات SpO2 عالية بشكل غير متوقع في كل من نموذج Pseudomonas aeruginosa 3 ، والتي ليست مرضا تنبؤيا أو محتضرا ، على الأرجح لأن الفئران يمكنها تعديل نشاطها الفسيولوجي. تحقيقا لهذه الغاية ، لم يتم العثور على مستويات تشخيصية من SpO2 لأمراض الجهاز التنفسي البكتيرية في الفئران حتى الآن.
لذلك ، بحث هذا العمل في استخدام طرق أخرى ذات صلة سريريا للكشف عن آثار أمراض الرئة على وظائف الرئة كقياس فسيولوجي سريع. يوفر تخطيط التحجم المبسط لكامل الجسم (sWBP) الفرصة للتحقيق في معدل التنفس وعمقه كتحليل بيومتري سريع وغير جراحي. أظهرت الدراسات السابقة كيفية تجميع جهاز WBP في المختبر4 ؛ ومع ذلك ، فإن العديد من المكونات الموضحة في مثل هذه الدراسات غير متوفرة تجاريا حاليا. علاوة على ذلك ، يتطلب WBP التقليدي جمع البيانات المعقدة ومعالجة البيانات بناء على الرطوبة ودرجة الحرارة 5,6. ومن ثم ، فقد تقرر تطوير جهاز WBP مبسط يتم معايرته يوميا لدرجة حرارة / رطوبة الغرفة وتقييم ما إذا كانت مساهمة درجة الحرارة / الرطوبة للموضوع نفسه لها أي تأثير على حجم التنفس المقاس أم لا. وبالتالي ، تم إنشاء جهاز sWBP معدل والذي يوفر المواد المتاحة حاليا. علاوة على ذلك ، تم التحقيق فيما إذا كان هذا الجهاز من مصادر معملية يمكنه اكتشاف التغيرات في التنفس المرتبطة بتطور المرض خلال نموذج داء الميليويد التنفسي القاتل في الفئران.
استخدم جهاز sWBP الذي تم إنشاؤه لهذا العمل المعدات والبرامج المتاحة تجاريا لمعالجة بيانات مستشعر الضغط التناظري في قراءات رقمية. تم تركيب مستشعر الضغط في وعاء زجاجي محكم الإغلاق مع موصلات الحاجز. تتمثل فائدة الجرة الزجاجية في الصلابة الهيكلية للمادة ، والتي ستقاوم التغيرات في الضغط الداخلي للجرة ، مما يؤثر على قياسات تغيرات الحجم أثناء مراقبة التنفس. تم تصميم غرفة أخذ العينات لتحتوي على منفذين على السطحين المستويين للجرة المربعة ، أحدهما للوصول إلى الغرفة بواسطة موصل Luer للمعايرة والآخر لإيواء مستشعر الضغط. يحتوي مستشعر الضغط المحدد على محول ضغط مقياس حساس للغاية مع نطاق للتغيرات الصغيرة في الضغط (نطاق 25 ملي بار).
يتم توضيح هذا البروتوكول باستخدام نموذج الفئران من داء الميليويد التنفسي. Burkholderia pseudomallei (Bp) هو العامل البكتيري لداء الميليويد – وهو مرض مرتبط بالمناطق الاستوائية في العالم7. تم العثور على BP في البيئة ، وتحديدا في البيئات الرطبة للمياه الراكدة والتربة الرطبة ، والتي تسبب عادة التهابات تحت الجلد من جروح / خدوش المضيفين المعرضين للإصابة. ومع ذلك ، فإن Bp معدي أيضا عند استنشاقه ويشكل تهديدا محتملا للاستخدام في الإرهاب البيولوجي عن طريق تشتت الهباء الجوي. بينما يتطلب Bp الخبيث بالكامل التعامل معه في مختبر BSL-3 ، فقد تم تصميم سلالة متحولة كبسولية مسبقا ، والتي يمكن التعامل معها بأمان في BSL-2 واستبعادها من معايير العامل المحدد8. علاوة على ذلك ، تم تطوير نموذج عدوى داخل القصبة الهوائية بوساطة التنبيب (IMIT) لداء الميليويد التنفسي لدراسة تطور أمراض الجهاز التنفسي ل Bp 5,9. لقد استخدمنا نموذج العدوى هذا لتوصيف التغير في التنفس الذي يحدث أثناء تطور المرض من خلال نقطة النهاية المحتضرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
sWBP هو نهج جذاب لتعزيز فهم عدوى الجهاز التنفسي في نماذج الحيوانات الصغيرة. الأهم من ذلك ، أنه نهج غير جراحي ، وعلى هذا النحو ، فإنه لا يشكل خطرا كبيرا للتسبب في إجهاد لا داعي له لحيوانات البحث أثناء تحدي العدوى. في الواقع ، فإن إجراء مراقبة تنفس الموضوع هو اختبار سريع يتطلب عدة دقائق والحد الأدنى من التعامل مع الموضوع. الفائدة العلمية هي الفهم عالي الدقة لكيفية تأثير مسببات الأمراض الميكروبية على وظائف الرئة أثناء المرض. سيوفر هذا النهج فائدة للبحوث الأساسية ، مما يسهل فهم كيفية تسبب العامل الممرض في المرض ، بالإضافة إلى توفير فائدة انتقالية لفهم كيف يعيد العلاج الجديد موضوع البحث إلى حالة صحة الجهاز التنفسي.
في هذه المخطوطة ، يتم تقديم نتائج تمثيلية للممرض B. pseudomallei ، الذي يسبب استجابة خاملة مبكرة. ليست كل التهابات الرئة البكتيرية موجودة بنفس الطريقة في نماذج عدوى الفئران. أظهرت التجربة السابقة مع نماذج العدوى الأخرى أن العامل الممرض البكتيري Klebsiella pneumoniae يظهر كعدوى بدون أعراض حتى النقطة التي تستسلم فيها الفئران للعدوى ، أيضا في اليوم 3 تقريبا بعد الإصابة11. يفترض أن طلب المضيف على الهواء المستوحى (أي الحجم الدقيق) قد يرتبط ارتباطا وثيقا بدرجة الخمول التي يظهر بها مرض معين. ستكون هناك حاجة إلى دراسات مستقبلية لفحص كيفية تأثير مسببات الأمراض البكتيرية المختلفة على وظائف الرئة أثناء أمراض الجهاز التنفسي. من المفهوم أن مسببات الأمراض المختلفة لها طرق فريدة للتهرب من دفاع المضيف ، بما في ذلك الاختلافات في ، (1) الميل إلى أن تكون مسببات الأمراض داخل الخلايا أو خارج الخلية ، (2) القدرة على التسبب في استجابة منخفضة الحرارة مبكرة / متأخرة ، و (3) استخدام ذخيرة مختلفة من محددات الفوعة3،12،13. لذلك ، من المحتمل أن تؤدي استراتيجيات المرض المختلفة إلى تأثيرات فريدة على وظائف الرئة والتنفس أثناء العدوى.
يمكن تعديل الإعدادات الموصى بها الموضحة في هذا البروتوكول لاستيعاب التحديات الفريدة الموجودة أثناء sWBP. واحدة من القضايا الشائعة التي تواجهها أثناء جلسة تسجيل sWBP هي حركة الموضوع داخل غرفة العينة. كما ذكرنا ، تعدل هذه الحركة خط الأساس ويمكن أن تؤثر على دقة قياسات التنفس. تم استخدام مرشح رقمي لتطبيع خط الأساس المتغير ، مما يسمح بقياسات التنفس القابلة للتطبيق على الرغم من الحركات الصغيرة. يمكن أن تؤدي الحركة المفرطة إلى دفع قياس خط الأساس خارج نطاق المدخلات الصفرية. يوصى بالتسجيلات في نطاق 1 مللي فولت (إعداد القناة 1) ، والذي يوفر حلا وسطا لاستمرار مراقبة قمم تخطيط التحجم مع تجنب فقدان البيانات خارج النطاق. بالنسبة للأهداف النشطة بشكل استثنائي ، قد يكون من الضروري توسيع نطاق التسجيل >1 مللي فولت لتجنب الإشارات المستمرة خارج النطاق.
يتطلب الإجراء الموصى به معايرة يومية (أو في كل جلسة) لاستيعاب تقلبات الرطوبة / درجة الحرارة البيئية. يستخدم WBP التقليدي حسابات معقدة تأخذ في الاعتبار درجة الحرارة / الرطوبة لكل من البيئة والموضوع 5,6. لقد ثبت أنه في جهاز sWBP الحالي ، لا تغير تأثيرات درجة حرارة / رطوبة المضيف بشكل كبير حجم التنفس المقاس لمصدر المعايرة. لذلك ، يختلف هذا النهج في sWBP اختلافا جوهريا عن نهج Drorbaugh و Fenn البالغ من العمر >50 عاما. هنا ، يربط sWBP بشكل مباشر تغيرات الضغط بحجم التنفس المقاس دون مزيد من التصحيح من المضيف.
من الضروري مقارنة WBP الحيواني البحثي ب WBP السريري. أنواع البيانات البيومترية التي تمت محاولة جمعها بواسطة sWBP هي حجم التنفس وتردده. يتم جمع هذه القياسات سريريا باستخدام معدات قياس التنفس البسيطة التي يمسك فيها المريض بجهاز مراقبة التنفس في فمه ويتنفس بشكل طبيعي في جهاز يراقب تدفق الهواء. يتطلب قياس التنفس المماثل في البحث ضبط النفس ، مما يساهم في الإجهاد واضطراب متأصل في التنفس. لذلك ، فإن قياس التنفس البسيط يعمل سريريا ولكن ليس لحيوانات البحث. يخدم WBP غرضا أساسيا في العيادة لجمع البيانات المتقدمة ، بما في ذلك قياسات مثل حجم الرئة المتبقي. لا يمكن احتواء هذه البيانات إلا في سياق قدرة الشخص على اتباع التعليمات حول كيفية تنفسه ، بما في ذلك انتهاء الصلاحية القسري (إفراغ رئته عن طريق الزفير العميق). لا يمكن الاعتماد على البحث لاتباع تعليمات التنفس من الباحث. لا يمكن استنساخ العديد من القياسات المتقدمة التي تم جمعها سريريا خلال WBP في البحث. يختلف WBP في البحث اختلافا جوهريا عن WBP السريري. يسعى Animal WBP إلى جمع بيانات تهوية بسيطة (معدل التنفس وحجمه) بطريقة غير مقيدة لتجنب إجهاد الحيوانات واضطراب التنفس. حتى الآن ، يبدو أن استخدام WBP في البحث يكرر التقنيات المستخدمة في WBP السريري ، بما في ذلك الحسابات المعقدة القائمة على درجة الحرارة والرطوبة البيئية والموضوعية ، ولكن دون القدرة على جمع البيانات المتقدمة من موضوع يمكنه اتباع التعليمات حول كيفية إجراء انتهاء الصلاحية القسري. مع وضع ذلك في الاعتبار ، تم السعي إلى إثبات ما إذا كانت نسخة مبسطة من WBP كافية لجمع تواتر التنفس ذي الصلة وحجمه ذي الصلة بدراسات أمراض الجهاز التنفسي. تم استخدام جلسة معايرة ، والتي عوضت عن أي اختلاف في درجة الحرارة والرطوبة البيئية. علاوة على ذلك ، تم إثبات ذلك باستخدام فأر اصطناعي أن درجة الحرارة والرطوبة لحجم التنفس المقاس ليس لها تأثير كبير على قياس حجم التنفس بدقة. تم التوصل إلى أن sWBP له تطبيق ممتاز للبحث في الدراسات على الحيوانات ، دون الحاجة إلى المستخدم لاستخدام معالجة رياضية مرهقة للبيانات.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسات من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة COBRE P20GM125504-01 المشروع الفرعي 8246.
Materials
| 1/8" NPT Luer adaptor | Amazon | B07DH9MY8W | Calibration port |
| 1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor | Amazon | B07T6CR6FS | Bulkhead to luer adaptor |
| 150 kohm resistor | Amazon | B07GPRYL81 | Pressure transducer excitation voltage selection |
| 3/4" diamond drill bit | Drilax | DRILAX100425 | To drill bulkhead mounts in glass jar |
| Bridge Amp | AD Instruments | FE221 | One channel option |
| Bulkhead fitting | Legines | 3000L-B | 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling |
| Chaney adaptor | Hamilton | 14725 | Gas tight syringe adaptor for set volume |
| DIN connector | AD Instruments | SP0104 | To connect pressure sensor to Bridge Amp |
| Gastight syringe, 25 uL | Hamilton | 80201 | Calibration syringe |
| LabChart | AD Instruments | Life Science Data Acquisition Software | |
| Luer plug | Cole Parmer | 45513-56 | Calibration port closure |
| PowerLab 4/26 | AD Instruments | PL2604 | Digital interface to computer |
| Pressure transducer | Omega Engineering | PX409-10WGV | High accuracy oil filed gage pressure sensor |
| Rubber gasket | Amazon | B07LH4C8LS | To mount bulkheads (4 required per chamber) |
| Square glass jar | Amazon | B07VNSPR8P | 600 ml with 95 mm silicone gasket |
Referencias
- Warawa, J. M., Long, D., Rosenke, R., Gardner, D., Gherardini, F. C. Role for the Burkholderia pseudomallei capsular polysaccharide encoded by the wcb operon in acute disseminated melioidosis. Infection and Immunity. 77 (12), 5252-5261 (2009).
- West, T. E., Myers, N. D., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Murine pulmonary infection and inflammation induced by inhalation of Burkholderia pseudomallei. International Journal of Experimental Pathology. 93 (6), 421-428 (2012).
- Lawrenz, M. B., et al. Development and evaluation of murine lung-specific disease models for Pseudomonas aeruginosa applicable to therapeutic testing. Pathogens and Disease. 73 (5), (2015).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51755 (2014).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Simon, G., Pride, N. B., Jones, N. L., Raimondi, A. C. Relation between abnormalities in the chest radiograph and changes in pulmonary function in chronic bronchitis and emphysema. Thorax. 28 (1), 15-23 (1973).
- Gassiep, I., Armstrong, M., Norton, R. Human melioidosis. Clinical Microbiology Reviews. 33 (2), 06-19 (2020).
- Gutierrez, M. G., Warawa, J. M. Attenuation of a select agent-excluded Burkholderia pseudomallei capsule mutant in hamsters. Acta Tropica. 157, 68-72 (2016).
- Gutierrez, M. G., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. Type 3 secretion system cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (1), 3441 (2015).
- Rocco, P. R. M., Zin, W. A., Gullo, A. . Anaesthesia, Pain, Intensive Care and Emergency Medicine. , (2002).
- Fodah, R. A., et al. Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model. PLoS One. 9 (9), 107394 (2014).
- Gotts, J. E., et al. Clinically relevant model of pneumococcal pneumonia, ARDS, and nonpulmonary organ dysfunction in mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (5), 717-736 (2019).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host & Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
