Un sistema optimizado de O9-1/hidrogel para estudiar señales mecánicas en células de cresta neural

Las células de la cresta neural (NCC) son un grupo de células madre durante la embriogénesis de vertebrados con una notable capacidad para migrar y contribuir al desarrollo de diversos órganos y tejidos. Los NCC pueden diferenciarse en diferentes tipos de células, incluidas las neuronas sensoriales, el cartílago, el hueso, los melanocitos y las células del músculo liso, dependiendo de la ubicación del origen axial y la orientación ambiental local del NCC^1,2. Con la capacidad de diferenciarse en una amplia gama de tipos de células, las anomalías genéticas que causan desregulación en cualquier etapa del desarrollo de la cresta neural (NC) pueden conducir a numerosas enfermedades congénitas². Por ejemplo, las perturbaciones durante la formación, migración y desarrollo de las NCC conducen a trastornos del desarrollo conocidos colectivamente como neurocristopatías^1,3. Estas enfermedades van desde defectos craneofaciales debido a fallas en la formación de NCC, como el síndrome de Treacher Collins, hasta el desarrollo de varios cánceres debido a la capacidad migratoria metastásica de NCC, como se ve en el melanoma^3,4,5,6. En las últimas décadas, los investigadores han hecho descubrimientos notables sobre los roles y mecanismos de los NCC en el desarrollo y las enfermedades, y la mayoría de los hallazgos se centran en las señales químicas^7,8. Más recientemente, se ha indicado que las señales mecánicas desempeñan un papel crítico pero poco comprendido en el desarrollo de NCC^9,10.

Las señales ambientales de los NCC juegan un papel crítico durante su desarrollo, incluida la regulación de la diferenciación de NCC en varios tipos de células. Las señales ambientales, por ejemplo, las señales físicas, influyen en los comportamientos fundamentales y las respuestas celulares, como la diversificación funcional. La mecanotransducción permite a las células detectar y responder a esas señales para mantener diversos procesos biológicos². Los NCC están rodeados de células vecinas y diferentes sustratos, como la matriz extracelular (ECM), que puede dar lugar a estímulos mecánicos para mantener la homeostasis y adaptarse a los cambios a través de la determinación del destino, la proliferación y la apoptosis¹¹. La mecanotransducción comienza en la membrana plasmática donde se produce el componente sensorial de los estímulos mecánicos extracelulares, dando lugar a la regulación intracelular de la célula¹². Las integrinas, las adherencias focales y las uniones de la membrana plasmática transmiten señales mecánicas, como las fuerzas de cizallamiento, la tensión y la rigidez de los sustratos circundantes, en señales químicas para producir respuestas celulares¹². La retransmisión de señales químicas desde la membrana plasmática hasta la regulación celular final se lleva a cabo a través de diferentes vías de señalización para finalizar procesos vitales para el organismo, como la diferenciación.

Varios estudios han sugerido que la señalización mecánica de la rigidez del sustrato juega un papel en la diferenciación celular^13,14. Por ejemplo, estudios previos han demostrado que las células madre mesenquimales (MSC) cultivadas en sustratos blandos con una rigidez similar a la del tejido cerebral (en el rango de 0.1-1.0 kPa) resultaron en la diferenciación de células neuronales^15,16. Sin embargo, más MSC se diferencian en células similares a los miocitos cuando se cultivan en sustratos de 8-17 kPa que imitan la rigidez del músculo, mientras que la diferenciación similar a los osteoblastos se observó cuando las MSC se cultivaron en sustratos rígidos (25-40 kPa)^15,16. La importancia de la mecanotransducción se destaca por las irregularidades y anomalías en la vía de señalización mecánica que potencialmente conducen a defectos y enfermedades graves del desarrollo, incluidos el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y la osteoporosis^17,18,19. En los cánceres, el tejido mamario normal es blando, y el riesgo de cáncer de mama aumenta en el tejido mamario rígido y denso, un ambiente que es más parecido a los tumores de mama¹⁵. Con este conocimiento, los efectos de la señalización mecánica en el desarrollo de NCC se pueden estudiar a través de la manipulación simple de la rigidez del sustrato a través de un sistema in vitro, proporcionando más ventajas y posibilidades para comprender los fundamentos de la progresión y etiología de la enfermedad relacionada con NC.

Para estudiar el impacto de las señales mecánicas en los NCC, establecimos un sistema in vitro eficiente para ncCs basado en la optimización de métodos previamente publicados y la evaluación de las respuestas de los NCCs a diferentes señales mecánicas^20,21. Se proporcionó un protocolo detallado para la preparación de la rigidez variable del hidrogel y la evaluación del impacto de la señalización mecánica en los NCC. Para lograr esto, los NCC O9-1 se utilizan como modelo NC para estudiar los efectos y cambios en la respuesta a los hidrogeles rígidos frente a los blandos. Los NCC O9-1 son una línea celular NC estable aislada del embrión de ratón (E) en el día 8.5. Los NCC de O9-1 imitan a los NCC in vivo porque pueden diferenciarse en varios tipos de células derivadas de NC en medios de diferenciación definidos²². Para estudiar la señalización mecánica de los NCC, se fabricó un sustrato de matriz con elasticidad sintonizable a partir de concentraciones variables de soluciones de acrilamida y bisacrilamida para lograr la rigidez deseada, correlacionándose con la rigidez biológica del sustrato^20,21,23. Para optimizar las condiciones de sustrato matricial para NCCs, específicamente células O9-1, se realizaron modificaciones a partir del protocolo²⁰previamente publicado. Un cambio realizado en este protocolo fue incubar hidrogeles en colágeno I, diluidos en ácido acético al 0,2% en lugar de 50 mM HEPES, a 37 °C durante la noche. El bajo pH del ácido acético conduce a una distribución homogénea y una mayor incorporación de colágeno I, lo que permite una unión más uniforme de la proteína ECM²⁴. Además, se utilizó una combinación de suero de caballo y suero fetal bovino (FBS) en las concentraciones de 10% y 5% en solución salina tampón de fosfato (PBS), respectivamente, antes de almacenar los hidrogeles en la incubadora. El suero de caballo se utilizó como un suplemento adicional a FBS debido a su capacidad para promover la proliferación y diferenciación celular a la concentración de 10%²⁵.

Con este método, un entorno biológico fue imitado por el recubrimiento de proteína ECM (por ejemplo, colágeno I) para crear un entorno in vitro preciso para que los NCC crezcan y sobrevivan^20,21. La rigidez de los hidrogeles preparados se analizó cuantitativamente mediante microscopía de fuerza atómica (AFM), una técnica bien conocida para representar el módulo elástico²⁶. Para estudiar el efecto de diferentes niveles de rigidez en los NCC, se cultivaron células O9-1 de tipo salvaje y se prepararon en hidrogeles para la tinción de inmunofluorescencia (IF) contra la actina filamentosa (F-actina) para mostrar las diferencias en la adhesión celular y las morfologías en respuesta a los cambios en la rigidez del sustrato. Utilizando este sistema in vitro, los investigadores podrán estudiar las funciones de la señalización mecánica en los NCC y su interacción con otras señales químicas para obtener una comprensión más profunda de la relación entre los NCC y la señalización mecánica.