Kernmigration in der Drosophila-Eizelle

Seit einigen Jahren hat sich die Drosophila-Eizelle als Modellsystem zur Untersuchung der Kernmigration herauskristallisiert. Die Drosophila-Eizelle entwickelt sich in einer mehrzelligen Struktur, die als Eizelle bezeichnet wird. Eizellen umfassen 16 Keimzellen (15 Ammenzellen und die Eizelle), die von einer Epithelschicht aus follikulären somatischen Zellen umgeben sind. Die Entwicklung der Eikammer wurde in 14 Stadien unterteilt (Abbildung 1A), in denen die Eizelle wächst und Reserven ansammelt, die für die frühe Entwicklung des Embryos erforderlich sind. Während der Entwicklung, bei Mikrotubuli-Reorganisation und asymmetrischem Transport mütterlicher Determinanten, polarisiert die Eizelle entlang der antero-dorsalen und dorso-ventralen Achsen. Diese Achsen bestimmen die nachfolgenden Polaritätsachsen des Embryos und des Erwachsenen, die aus der Befruchtung dieser Eizelle^{entstehen 1}. Während der Oogenese nimmt der Kern eine asymmetrische Position in der Eizelle ein. Im Stadium 6 ist der Kern in der Zelle zentriert. Nach einem noch zu identifizierenden Signal, das von den hinteren Follikelzellen emittiert wird, das von der Eizelle empfangen wird, wandert der Kern in Richtung des Schnittpunkts zwischen den vorderen und lateralen Plasmamembranen in Stadium 7 (Abbildung 1B)^2,3. Diese asymmetrische Position ist erforderlich, um die Bestimmung der dorso-ventralen Achse zu induzieren.

Abbildung 1: Drosophila melanogaster Eierkammern. (A) Festes Ovariol von transgenen Fliegen, die Fs(2)Ket-GFP exprimieren, das die Kernhüllen kennzeichnet, und ubi-PH-RFP, das die Plasmamembranen kennzeichnet. Das Ovariol besteht aus sich entwickelnden Eierkammern in verschiedenen Stadien. Die Reifung nimmt entlang der antero-posterioren Achse mit dem Keimarium an der vorderen Spitze (links), wo sich die Keimstammzelle befindet, und dem älteren Stadium an der hinteren Spitze (rechts) zu. (B) Z-Projektion der lebenden Eikammer durch Spinnscheibenkonfekularmikroskopie im Stadium 6 der Oogenese (links), bei der der Kern in der Eizelle zentriert ist. Der Zellkern wandert, um im Stadium 7 (rechts) in Kontakt mit der vorderen Plasmamembran (zwischen der Eizelle und der Ammenzelle) und der lateralen Plasmamembran (zwischen der Eizelle und den Follikelzellen) eine asymmetrische Position einzunehmen. Diese Position induziert die Bestimmung der dorsalen Seite und damit der dorso-ventralen Achse der Eikammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Seit vielen Jahrzehnten wird diese Kernmigration an fixierten Geweben durch Immunfärbung untersucht. Dieser Ansatz hat es insbesondere ermöglicht zu zeigen, dass dieser Prozess von einem dichten Netzwerk von Mikrotubuli^{abhängt 4,5}. In jüngerer Zeit haben wir ein Protokoll entwickelt, das Bedingungen bietet, die mit der Live-Bildgebung der Eizelle während mehrerer Stunden kompatibel sind, so dass es möglich ist, diesen Prozess dynamisch zu untersuchen⁶.

So konnten wir erstmals beschreiben, dass der Zellkern während seiner Migration bevorzugte und charakteristische Trajektorien aufweist, eine entlang der vorderen Plasmamembran (APM) und eine entlang der lateralen Plasmamembran (LPM) der Eizelle (Abbildung 2). Diese neuesten Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von Live-Imaging-Protokollen bei der Untersuchung dynamischer Prozesse wie der nuklearen Migration.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der verschiedenen Migrationspfade des Kerns. Im Stadium 6 der Oogenese ist die Eizelle eine große Zelle mit einem zentralen Kern. In diesem Stadium wird die antero-posteriore Polaritätsachse mit einer posterioren/lateralen Plasmamembran der Eizelle in Kontakt mit den Follikelzellen eingestellt und die vordere Plasmamembran (in gelb) ist in Kontakt mit den Ammenzellen². Wir haben bereits berichtet, dass der Zellkern entweder entlang der vorderen Plasmamembran (APM), entlang der lateralen Plasmamembran (LPM) oder durch das Zytoplasma (STAD, direkt zum antero-dorsalen Kortex) wandern könnte⁶. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Migration des Eizellkerns ist ein Phänomen von etwa 3 h⁶, und bisher ist das Ereignis, das den Beginn der tatsächlichen Migration auslöst, unbekannt. Der Beginn der Migration kann auch durch Proteinmutanten verzögert werden, die zur Untersuchung dieses Mechanismus verwendet werden. Diese unbekannten Variablen motivierten uns, Bilder über lange Zeiträume (10-12 h) zu erfassen. Es ist daher wichtig sicherzustellen, dass die Eizellen am Leben bleiben. Während sich die Eierkammer entwickelt, verlängert sie sich entlang der antero-posteriären Achse von einer kugelförmigen zu einer elliptischen Form. Diese Dehnung wird durch die Rotation von Follikelzellen angetrieben, die von Stadium 1 bis Stadium 8 senkrecht zur antero-posteriolen^{Achse 7}auftritt. Darüber hinaus umgibt eine röhrenförmige Muskelscheide mit pulsierender Eigenschaft die Eierkammern. Seine physiologische Funktion besteht darin, die sich entwickelnden Follikel kontinuierlich in Richtung Eileiter zu drücken⁸. Um die Bewegungen zu begrenzen, die nach ihrer Dissektion Schwingungen der Eikammern auslösen, haben wir eine Beobachtungsmikrokammer mit einer Höhe von 150 μm entworfen (Abbildung 3A). Diese Höhe ist geringfügig höher als die Größe eines Follikels in den Stadien 10 und 11. Es schränkt die vertikalen Bewegungen der Probe erheblich ein und bewahrt gleichzeitig die Rotation der Eikammer, was zu begrenzten Defekten in der Follikelentwicklung führt. Wir führen dann Live-Bildgebung für 12 h auf sezierten Eierkammern durch Multi-Position-Zeitraffer-Erfassungen mit einem Spinnscheiben-Konfokalmikroskop durch. Hier beschreiben wir unser Protokoll zur Untersuchung der Eizellkernmigration zwischen den Stadien 6 und 7.

Abbildung 3: Schematische Darstellung der Beobachtungskammer. (A) (Drehe) Genaue Abmessungen des Aluminiumschlittens mit den Höhen (A’) und Dem Umfang (A”) des in der Mitte des Schlittens gebohrten Brunnens. (B) (Unteransicht) Ein Abdeckr, der den Brunnen blockiert, wird mit Silikonfett zum Schlitten abgedichtet. (C) (Dranansicht) Sezierte Ovariolen entwickeln sich in einem bildgebenden Medium, das von einer gasdurchlässigen Membran bedeckt ist. Halogenkohlenstofföl wird verwendet, um die Membran zu stabilisieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Um die Kernmigration zu verfolgen und die Trajektorien in der Eizelle genau beurteilen zu können, werden Marker sowohl für die Kernhülle als auch für die Plasmamembran benötigt. Zu diesem Zweck wurden zwei Transgene ausgewählt, die ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen und im Verlauf der Live-Bildgebung nicht verblassen. Zur Kennzeichnung der Plasmamembran wird die Verwendung eines P[ubi-PH-RFP] empfohlen, der die Pleckstrin Homology (PH)-Domäne der humanen Phospholipase C ∂1 (PLC∂1) kodiert, die mit RFP verschmolzen ist. Diese PH-Domäne bindet an das Phosphoinositid PI(4,5)P2, das entlang der Plasmamembran der Eizelle⁹verteilt ist. Für die Kernhülle zeigt der P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP-Proteinfallenstamm, bei dem GFP in das Gen eingefügt wird, das für das Drosophila ß-Importin kodiert, ein homogenes und intensives Signal¹⁰. Junge Fliegen (1-2 Tage alt) werden 24-48 h vor der Eierstockdissektion in frische Fläschchen mit Trockenhefe gelegt.

Für diesen Live-Imaging-Assay wurde ein 1 mm dickes Stück Aluminium, das für die Probe nicht reaktiv ist, in die Abmessungen eines Objektträgers geschnitten. Es hat ein Loch mit einem Durchmesser von 16 mm in der Mitte des Schlittens, das auf 0,85 mm gegenbohrt wurde. Diese Gegenbohrung hat eine zusätzliche Bohrung mit 6 mm Durchmesser und einer Tiefe von 150 μm (Abbildung 3A). Ein Abdeckrlip wird mit Silikonfett (inert für die Probe) am Boden der Aluminiumkammer verklebt (Abbildung 3B). Nach dem Einbringen der Proben in die mediumgefüllte Vertiefung wird eine Membran, die durchlässig für_{O2/CO2-Austausch} ist, über das Medium gelegt und von Halogenkohlenstofföl umgeben (Abbildung 3C).

Für die Dissektion wird empfohlen, eine Edelstahlzette mit einem Spitzenmaß von 0,05 x 0,02 mm und Nadeln mit einem Durchmesser von 0,20 mm zur Trennung der Ovariolen zu verwenden (Abbildung 4B,C). Die wandernden Kerne werden auf einem konfokalen invertierten Spinning-Disk-Mikroskop CSU-X1 abgebildet, das mit einer Kamera ausgestattet ist. Multi-Position-Bilder wurden im Zeitraffer alle 15 minuten bei 24 °C aufgenommen. Ein Intervall von 15 Minuten ermöglicht die Durchführung von Multi-Position-Erfassungen mit begrenztem Photobleaching der fluoreszierenden Proteine und Phototoxizität für die Proben. Darüber hinaus würde ein kürzeres Intervall keine viel aussagekräftigeren Daten liefern, um die nuklearen Trajektorien zu verfolgen. Die Filme werden über die Fidschi-Software¹¹verarbeitet und analysiert.