온코연성 포진 심플렉스 바이러스의 성장, 정화 및 적정
Summary
이 원고에서는, 우리는 전임상 사용을 위한 온연성 포진 심플렉스 바이러스의 성장, 정제 및 적정의 간단한 방법을 설명합니다.
Abstract
종양용성 포진 심플렉스 바이러스(oHSV)와 같은 종양용액 바이러스(OV)는 암 면역요법 분야에서 빠르게 성장하는 치료 전략이다. oHSV를 포함한 OV는 항종양 면역을 유도하면서 암세포(건강/정상 세포를 아끼는)를 선택적으로 복제하고 죽입니다. 이러한 독특한 특성 때문에, oHSV 기반 치료 전략은 점점 더 암의 치료에 사용되고있다, 전임상 및 임상적으로, FDA 승인 탈리모진 laherparevec을 포함 (T-Vec). 성장, 정제 및 적정은 실험 연구에 활용되기 전에 oHSV를 포함한 모든 TV에 필수적인 실험실 기술입니다. 이 백서는 베로 세포에서 oHSV를 증폭시키는 간단한 단계별 방법을 설명합니다. oHSV가 증식함에 따라 베로 세포에서 세포 병증 효과 (CPE)를 생성합니다. 감염된 세포의 90-100%가 CPE를 나타내면, 부드럽게 수확되고, 벤조나제와 염화마그네슘(MgCl2)으로처리되고, 여과하고, 자당그라데이션 방법을 사용하여 정제를 실시한다. 정제 후, 전염성 oHSV(플라크 형성 유닛 또는 PfUs로 지정)의 수는 베로 세포의 “플라크 분석”에 의해 결정된다. 본 명세서에 기재된 프로토콜은 세포 배양 및 생체 내 동물 실험에서 체외 연구를 위해 고-티터 oHSV 스톡을 준비하는 데 사용될 수 있다.
Introduction
종양 분석 바이러스 (EV)는 암 면역 요법의 신흥 독특한 형태입니다. OV는 항종양면역2를유도하면서 종양 세포(정상/건강한 세포를 아끼는)1에서 선택적으로 복제및 용해된다. 온코일리틱 포진 심플렉스 바이러스(oHSV)는 모든 TV 중에서 가장 광범위하게 연구된 바이러스 중 하나입니다. 탈리모진 래에르파렙벡(T-VEC)이 미국에서 고급 흑색종3의치료를 위한 FDA 승인을 받은 최초의 유일한 OV인 것으로, 클리닉에서 가장 멀리 있다. T-VEC 이외에, 다른 많은 유전자 조작 된 oHSV는 다른 암유형3,4,5,6,7,8에서전임상 및 임상적으로 테스트되고 있다. 현재 진행된 재조합 DNA 생명공학은 치료형 트랜스진3,5에대한 새로운 oHSV코딩 엔지니어링의 타당성을 더욱 높이고있다. oHSV 전파, 정화 및 티터 결정의 효율적인 시스템은 시험관 내 및 생체 내 연구를 위해 테스트할 수 있는 (새로 개발된) oHSV전에 매우 중요합니다. 본 논문은 oHSV 성장(베로 세포), 정제(자당-그라데이션 방법에 의한), 적정(베로 세포의 oHSV 플라크 분석)의 간단한 단계별 방법을 설명합니다(도1). 그것은 쉽게 전임상 연구를위한 고품질의 바이러스 성 주식을 달성하기 위해 모든 생물 안전 수준 2 (BSL2) 실험실 설정에서 채택 될 수있다.
베로, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주, oHSV전파에가장 일반적으로 사용되는 세포주9,10,11,12,13 베로 세포는 결함이 있는 항 바이러스 인터페론 신호경로(14)이다. 인터페론 유전자(STING) 신호의 불활성화 된 자극기와 다른 세포주또한 oHSV 성장(12,13)에사용될 수있다. 이 프로토콜은 oHSV 성장 및 플라크 분석에 대한 베로 세포를 활용합니다. 전파후, oHSV-감염된 세포는 수확, 용해 및 정화를 실시하며, 이에 따라 용액 세포는 먼저 벤조나제 뉴클레아아제로 처리되어 숙주 세포 DNA를 저하시키고, 핵산 단백질 응집을 방지하며, 세포 용액의 점도를 감소시한다. 벤조나아제의 적절한 활성화는 종종 Mg2 +필요하므로, 1-2 mM MgCl2이 프로토콜에 사용된다15. 벤조나제 처리된 세포 용액의 숙주 세포 파편은 고속 자당 그라데이션 원심분리 전에 직렬 여과에 의해 더 제거된다. 점성 25% 자당 용액 쿠션은 자당층을 통한 바이러스 이동 속도가 느려지도록 하여 주전자 세포 관련 성분을 상복부에 남겨두어 펠릿16에서바이러스 손실을 정화및 제한하는 데 도움이 된다. 정제 된 oHSV는 다음 베로 세포에 titrated, 바이러스 플라크는 Giemsa 염색에 의해 시각화17 또는 X-갈 염색 (락즈 인코딩 oHSV에 대한)18.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜은 낮은 통로 베로 세포에서 oHSV의 성장으로 시작합니다. 베로 세포 단층의 합류는 자란 세포가 베로세포(20)로oHSV 입력을 감소시킬 수 있는 단단한 섬유구조를 개발할 수 있기 때문에 바이러스 접종 시에 ~80%여야 한다. 일단 90-100% CPE가 관찰되면, 배양 상체가 제거되고, 세포가 수확되고, VB/수퍼나탄트에서 재장매되고(단계 1.4.6 참조), 스냅 냉동, 및 나중에 정화를 위해 -8…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
사하 연구소의 연구는 법무부 (W81XWH-20-1-0702)와 닷지 존스 재단 – 애빌렌의 자금에 의해 부분적으로 지원되었다. 새뮤얼 D. 랍킨과 멜리사 R.M 험프리는 NIH(R01 CA160762)의 지원을 부분적으로 받았습니다.
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
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