Caenorhabditis elegans'ta Dendritik Dikenleri Görüntüleme
Summary
Dendritik dikenler sinir sisteminin önemli hücresel özellikleridir. Burada C. elegans’ta dendritik dikenlerin yapısını ve işlevini değerlendirmek için canlı görüntüleme yöntemleri tanımlanmıştır. Bu yaklaşımlar, dendritik omurga şeklini veya işlevini tanımlayan genler için mutant ekranların geliştirilmesini desteklemektedir.
Abstract
Dendritik dikenler, aktivite tarafından modüle edilen sinaptik innervasyonun uzmanlaşmış bölgeleridir ve öğrenme ve hafıza için substratlar olarak hizmet eder. Son zamanlarda, DD GABAerjik nöronlar için dendritik dikenler, Caenorhabditis elegans’ın motor devresindeki presinaptik kolinerjik nöronlardan giriş bölgeleri olarak tanımlanmıştır. Bu sinaptik devre şimdi omurga morfogenezinin güçlü bir in vivo modeli ve kolay genetiğinden ve C’nin hazır erişilebilirliğinden yararlanan fonksiyon olarak hizmet edebilir . elegans canlı hücre görüntülemeye.
Bu protokol, DD omurga yapısını ve fonksiyonunu değerlendirmek için deneysel stratejileri açıklar. Bu yaklaşımda, aktin bakımından zengin dendritik dikenlerin karmaşık şekillerini görselleştirmek için süper çözünürlüklü bir görüntüleme stratejisi kullanılmaktadır. DD omurga fonksiyonunu değerlendirmek için, ışıkla aktive olan opsin, Chrimson, presinaptik kolinerjik nöronları uyarır ve kalsiyum göstergesi GCaMP, postsinaptik DD dikenlerinde uyarılmış kalsiyum geçicilerini bildirir. Birlikte, bu yöntemler, C. elegans’taki dendritik dikenlerin genetik belirleyicilerini tanımlamak için güçlü yaklaşımlar içerir ve bu da omurga morfogenezini ve beyindeki işlevi yönlendirebilir.
Introduction
Dendritik dikenler, sinaptik iletim için komşu nöronlardan girdi alan özel hücresel yapılardır. Nörotransmitter reseptörlerinin aktivasyonu, bu karakteristik nöronal çıkıntılarda hücre içi kalsiyum ve aşağı akış sinyal yollarını yükseltir1. Dendritik omurgaların nörotransmisyon için temel önemi ve nörogelişimsel hastalıklarda yanlış düzenlenmesi nedeniyle1, dendritik omurga morfogenezini ve fonksiyonunu modüle eden faktörlerin keşfi nörobilim alanına büyük ilgi duymaktadır.
Son zamanlarda, C. elegans sinir sisteminde, memeli dikenleri 2 ile paylaşılan temel özelliklere dayanan dendritikdikenler tanımlanmıştır. Bu kararlılık çok önemlidir, çünkü omurga biyolojisini araştırmak için C. elegans’ın avantajlarından yararlanma olasılığını ortaya çıkarmaktadır. Dorsal D (DD) motor nöronlarındaki dendritik dikenler, ventral sinir kordonundaki kolinerjik nöronlardan (VA ve VB) girdi alırlar (Şekil 1A)2,3,4. Burada, DD dendritik dikenlerin yapısını ve canlı görüntüleme ve genetik analiz için kolayca erişilebilen sağlam bir sinir sisteminde in vivo işlevlerini araştırmak için görüntüleme yöntemleri sunulmaktadır. Dendritik dikenlerin şeklini izlemek için, (1) dendritik süreci ve dikenleri dolduran sitozolik floresan proteinler; (2) dendritik dikenlerin ve dendritlerin sınırını süsleyen membrana bağlı floresan proteinler; veya (3) dendritik dikenlerle zenginleştirilmiş aktin belirteçleri, LifeAct5 veya Utrophin6 kullanılır, böylece şekilleri ortaya çıkar. DD dikenlerinin işlevselliğini izlemek için, GCaMP floresansı, presinaptik kolinerjik nöronlarda kırmızıya kaymış opsin, Chrimson’un aktivasyonu ile uyarılan Ca ++ geçicilerini tespit etmek için kullanılır7. Her iki stratejinin de vahşi tip ve mutant hayvanlarda DD dendritik dikenlerin incelenmesini kolaylaştırması beklenmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Airyscan dedektörü, DD dikenlerinin anlık görüntülerini elde etmek için seçildi, çünkü geleneksel konfokal mikroskoplardan daha yüksek bir sinyal-gürültü oranı ve daha iyi çözünürlük sağlıyor19,20. AiryScan görüntüleme ayrıca, artık C. elegans için yaygın olarak bulunan geleneksel floresan proteinlerinin (örneğin, GFP, mCherry, vb.) kullanılmasına izin verir. Diğer süper çözünürlüklü yöntemlerle (örneğin, STORM, STED, PALM) daha yüksek çözünürlüklü görüntüler elde edilebilse de, bu yöntemler foto-aktive edilebilir veya foto-değiştirilebilir floresan proteinleri gerektirir21. Airyscan’a alternatif olarak, geleneksel konfokal mikroskoplar önerilir. Örneğin, Nyquist edinimi ile görüntüleme (Şekil 3), omurga morfolojik tiplerini ayırt etmek için yeterli olan 123.9 nm’lik 40x/1.3 hedefini kullanarak piksel boyutuna ulaşır (Şekil 2).
Omurga yoğunluğunu belirlemek için, (1) mCherry veya GFP, (2) Aktin sitoiskeletini etiketlemek için LifeAct veya (3) plazma zarını etiketlemek için bir miristotelize floresan proteini (örneğin, MYR::mRuby) kullanılması önerilir (Şekil 1B). Buna karşılık, F-aktin bağlayıcı protein Utrophin, omurga yoğunluğunu azaltır (Şekil 1C), Utrophin aşırı eksprese edildiğinde omurga morfogenezi üzerinde olumsuz bir etki olduğunu gösterir.
Mevcut görüntüleme yöntemleri, omurga morfolojisini yöneten genetik varyantların tanımlanmasına yardımcı olmalıdır 1,16. DD omurga morfolojisi (yani, ince / mantar, filopodial, inatçı, dallı, bakınız Şekil 2), ventral sinir kordonu lateral görüntülerinin tek 2D projeksiyonlarından değerlendirilebilir, çünkü çoğu DD dikeni karakteristik olarak ventralal olarak yönlendirilmiş bir oryantasyon benimser. Bu karşılaştırmalarda, her koşul için aynı floresan belirtecinin kullanılması esastır, çünkü görünür omurga morfolojik tipleri etiketleme yönteminden etkilenmiş gibi görünmektedir (örneğin, MYR::mRuby vs. LifeAct::GFP). Ek olarak, omurga şekillerinin dinamik olduğu ve muhtemelen dış sinyallere yanıt olarak şekil değiştirdiği belirtildi 2,16. Bu nedenle, benzer gelişim aşamalarında ve benzer koşullar altında genotipler arasındaki omurga şekillerini karşılaştırmak da önemlidir.
C. elegans ventral kordonunun oryantasyonu, doğru görüntü elde etmek için kritik öneme sahiptir. Hayvanın zıt taraflarındaki hem ventral hem de dorsal kordonlar, solucanın kendi tarafına yönlendirildiğini gösteren aynı Z-düzleminde görülmelidir (Şekil 1B). Ventral kordonun yakınındaki diğer solucanlar veya kabarcıklarla hareket eden veya temas halinde olan solucanların görüntülerini toplamamak en iyisidir, çünkü bu dikenlerin görüntülerini bozabilir.
İn vivo kalsiyum görüntüleme için, her edinimden hemen önce taze slaytların hazırlanması gerekir. Solucanları sadece ince tutkal lifleri ile temas halinde görüntülemek en iyisidir. Solucanları kurutmaya ve görüntüyü bozmaya meyilli tutkalın “globları” (Şekil 4B). Şekil 4’te gösterilen deneyde, 561 nm ışığın darbesi tüm görüş alanını aktive eder. Yerel Ca++ geçicilerini tespit etmek için zamansal ve uzamsal çözünürlüğü artırmak için, örneğin, bireysel DD dikenlerinde, 561 nm lazer hattı için kurulmuş bir galvo mini tarayıcı, daha küçük bir ilgi alanını uyarmak için kullanılabilir17.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Imaris üzerinde görüntüleme ve analizler NIH tarafından desteklenen Vanderbilt Hücre Görüntüleme Paylaşımlı Kaynağında (CIRS) gerçekleştirilmiştir (CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 ve EY08126). LSM 880, hibe 1S10OD201630 tarafından desteklenir. Nikon dönen diskte görüntüleme Nikon Center of Excellence’ta gerçekleştirildi. CISR direktörü Jenny Schafer’e ve Bryan Millis’e eğitim ve anlayışlı tartışmalar için ve Burnette laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz: Dylan Burnette, Aidan Fenix ve Nilay Taneja tavsiye için. Bu çalışma, DMM’ye Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri (R01NS081259 ve R01NS106951) ve ACC’ye Amerikan Kalp Derneği hibesi (18PRE33960581) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| All-trans retinal (ATR) | Sigma-Aldrich | R2500-100MG | Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson |
| diH2O | MilliQ | To prepare M9 buffer | |
| Ethanol 100% | Sigma | 64-17-5 | To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) | To immobilize animals for imaging dendritic spines | ||
| ImageJ | NIH | (Schindelin J et al., 2012) | Open source image processing software |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagents | 7758-11-4 | To prepare M9 buffer |
| Levamisole hydrochloride | Sigma | 16595-80-5 | To immobilize animals for imaging dendritic spines |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M63-500 | To prepare M9 buffer |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12542B | To mount animals for microscopy acquisition |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S369-500 | To prepare M9 buffer |
| NaCl | Fisher Chemical | S671-3 | To prepare M9 buffer |
| NIS Elements version 05.21 | Nikon | To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment) | |
| Polybeads carboxylate 0.05um microspheres | Polysciences, Inc | 15913-10 | To immobilize animals for imaging Ca++ transients |
| Prism | For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients | ||
| SeaKen ME agarose | Lonza | 50014 | To make agarose pads to mount animals for imaging |
| Super Glue | The gorilla company | To immobilize animals for imaging Ca++ transients | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 22-034-980 | To mount animals for microscopy acquisition |
| vaseline | Covidien | 8884430300 | To seal sample for confocal snapshots |
| Wax | Fisherbrand | 23-021-399 | Paraplast tissue embedding medium |
| Microscope for super-resolution imaging | |||
| LSM880 | Zeiss | ||
| AiryScan detector | Zeiss | ||
| Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm | |||
| Laser lines | |||
| Stage controller | |||
| Microscope for Nyquist image acquisition | |||
| A1R Confocal | Nikon | ||
| Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm | |||
| 488 nm, 16mW | |||
| 561 nm, 17mW | |||
| Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines | |||
| Spinning Disk Confocal | Nikon | ||
| Andor DU-897 EMCCD camera | |||
| Spinning disk Head CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm | |||
| 488 nm, 65mW | |||
| 561 nm, 86mW | |||
| 525 nm (+/- 18 nm) | |||
| 605 nm (+/- 35 nm) |
Referencias
- Sala, C., Segal, M. Dendritic Spines: The Locus of Structural and Functional Plasticity. Physiological Reviews. 94 (1), 141-188 (2014).
- Cuentas-Condori, A., et al. C. elegans neurons have functional dendritic spines. Elife. 8, 47918 (2019).
- Philbrook, A., et al. Neurexin directs partner-specific synaptic connectivity in C. Elegans. Elife. 7, 35692 (2018).
- Oliver, D., Alexander, K., Francis, M. M. Molecular Mechanisms Directing Spine Outgrowth and Synaptic Partner Selection in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Neuroscience. 12, 10-13 (2018).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- Ladt, K., Ganguly, A., Roy, S. Axonal actin in action: Imaging actin dynamics in neurons. Methods of Cell Biology. 131, 91-106 (2016).
- Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual color neural activation and behavior control with chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genética. 200 (4), 1029-1034 (2015).
- Mello, C., Kramer, J., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrahcormosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C . elegans Using Microinjection. Journal of Visualized Experiments. (18), e833 (2008).
- Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-specific expression profiling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developemntal Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
- Mccarter, J., Bartlett, B., Dang, T., Schedl, T. Soma – Germ Cell Interactions in Caenorhabditis elegans : Multiple Events of Hermaphrodite Germline Development Require the Somatic Sheath and Spermathecal Lineages. Developemntal Biology. 181 (2), 121-143 (1997).
- Driscoll, M. Mounting animals for observation with Nomarski DIC optics. WormBook. , (2008).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Hotulainen, P., Hoogenraad, C. C. Actin in dendritic spines connecting dynamics to function. Journal of Cell Biology. 189 (4), 619-629 (2010).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are They All the Same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Miller, D. M., Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121 (9), 2877-2886 (1995).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Ventral Nerve Cord of Caenorhadbitis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society. 275 (938), 327-348 (1976).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
- Huff, J. The Fast mode for ZEISS LSM 880 with Airyscan high-speed confocal imaging with super-resolution and improved signal-to-noise ratio. Nature Methods. 13, (2016).
- Jacquemet, G., Carisey, A. F., Hamidi, H., Henriques, R., Leterrier, C. The cell biologist’s guide to super-resolution microscopy. Journal of Cell Science. 133 (11), 240713 (2020).
