تصوير العمود الفقري التغصني في Caenorhabditis elegans
Summary
العمود الفقري التغصني هي السمات الخلوية الهامة للجهاز العصبي. هنا يتم وصف طرق التصوير الحية لتقييم بنية ووظيفة العمود الفقري الشجيري في C. elegans. تدعم هذه الأساليب تطوير شاشات متحولة للجينات التي تحدد شكل العمود الفقري الشجيري أو وظيفته.
Abstract
العمود الفقري الشجيري هي مواقع متخصصة للتعصيب المشبكي المعدل حسب النشاط وتعمل كركائز للتعلم والذاكرة. في الآونة الأخيرة ، تم وصف العمود الفقري التغصني للخلايا العصبية DD GABAergic كمواقع إدخال من الخلايا العصبية الكولينية قبل المشبكية في الدائرة الحركية ل Caenorhabditis elegans. يمكن أن تعمل هذه الدائرة المشبكية الآن كنموذج جديد قوي في الجسم الحي لتشكل العمود الفقري ووظيفته التي تستغل علم الوراثة السهل وسهولة الوصول إلى C. elegans لتصوير الخلايا الحية.
يصف هذا البروتوكول الاستراتيجيات التجريبية لتقييم بنية العمود الفقري DD ووظيفته. في هذا النهج ، يتم استخدام استراتيجية تصوير فائقة الدقة لتصور الأشكال المعقدة للأشواك المتغصنة الغنية بالأكتين. لتقييم وظيفة العمود الفقري DD ، يحفز الأوبسين المنشط بالضوء ، Chrimson ، الخلايا العصبية الكولينية قبل المشبكية ، ومؤشر الكالسيوم ، GCaMP ، يبلغ عن عابري الكالسيوم المثار في أشواك DD بعد المشبكي. تشتمل هذه الطرق معا على مناهج قوية لتحديد المحددات الجينية للأشواك المتغصنة في C. elegans والتي يمكن أن توجه أيضا تكوين العمود الفقري ووظيفته في الدماغ.
Introduction
العمود الفقري الشجيري هو تراكيب خلوية متخصصة تتلقى مدخلات من الخلايا العصبية المجاورة للانتقال المشبكي. يؤدي تنشيط مستقبلات الناقل العصبي إلى رفع الكالسيوم داخل الخلايا ومسارات الإشارات النهائية في هذه النتوءات العصبية المميزة1. نظرا للأهمية الأساسية للأشواك المتغصنة في النقل العصبي وسوء تنظيمها في أمراض النمو العصبي1 ، فإن اكتشاف العوامل التي تعدل تشكل العمود الفقري التغصني ووظيفته له أهمية كبيرة في مجال علم الأعصاب.
في الآونة الأخيرة ، تم تحديد العمود الفقري التغصني في الجهاز العصبي C. elegans بناء على الخصائص الرئيسية المشتركة مع أشواك الثدييات2. هذا التحديد أمر بالغ الأهمية لأنه يفتح إمكانية استغلال مزايا C. elegans للتحقيق في بيولوجيا العمود الفقري. تتلقى الأشواك المتغصنة على الخلايا العصبية الحركية الظهرية D (DD) مدخلات من الخلايا العصبية الكولينية (VA و VB) في الحبل العصبي البطني (الشكل 1 أ) 2،3،4. هنا ، يتم تقديم طرق التصوير لاستكشاف بنية العمود الفقري التغصني DD ووظيفتها في الجسم الحي في نظام عصبي سليم يمكن الوصول إليه بسهولة للتصوير الحي والتحليل الجيني. لمراقبة شكل العمود الفقري التغصني ، (1) بروتينات الفلورسنت الخلوية ، التي تملأ العملية المتغصنة والعمود الفقري ؛ (2) بروتينات الفلورسنت المرتبطة بالغشاء ، والتي تزين حدود العمود الفقري التغصني والتشعبات ؛ أو (3) يتم استخدام علامات الأكتين ، LifeAct5 أو Utrophin6 ، والتي يتم تخصيبها في العمود الفقري التغصني ، وبالتالي الكشف عن شكلها. لمراقبة وظائف العمود الفقري DD ، يتم استخدام مضان GCaMP للكشف عن عابرات Ca++ التي أثارها تنشيط الأوبسين الأحمر ، Chrimson ، في الخلايا العصبية الكولينية قبل المشبكية7. من المتوقع أن تسهل كلتا الاستراتيجيتين دراسة العمود الفقري التغصني DD في الحيوانات البرية والمتحولة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم اختيار كاشف Airyscan للحصول على لقطات من أشواك DD لأنه يوفر نسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى ودقة أفضل من المجاهر متحدة البؤر التقليدية19,20. يسمح تصوير AiryScan أيضا باستخدام بروتينات الفلورسنت التقليدية (على سبيل المثال ، GFP ، mCherry ، إلخ) ، وهي متاحة الآن على نطاق واسع ل C. elegans. على الرغم من أنه يمكن الحصول على صور عالية الدقة باستخدام طرق أخرى فائقة الدقة (على سبيل المثال ، STORM ، STED ، PALM) ، تتطلب هذه الطرق بروتينات فلورية قابلة للتنشيط الضوئي أو قابلة للتبديل الضوئي21. كبديل ل Airyscan، يوصى باستخدام المجاهر متحدة البؤر التقليدية. على سبيل المثال ، يحقق التصوير باستخدام اكتساب Nyquist (الشكل 3) حجم البكسل باستخدام هدف 40x / 1.3 يبلغ 123.9 نانومتر ، وهو ما يكفي لتمييز الأنواع المورفولوجية للعمود الفقري (الشكل 2).
لتحديد كثافة العمود الفقري ، يوصى باستخدام بروتين فلوري خلوي مثل (1) mCherry أو GFP ، (2) LifeAct لتسمية الهيكل الخلوي الأكتين ، أو (3) بروتين فلوري ميريستويل (على سبيل المثال ، MYR::mRuby) لتسمية غشاء البلازما (الشكل 1B). وبالمقارنة ، فإن بروتين ربط F-actin Utrophin يقلل من كثافة العمود الفقري (الشكل 1C) ، مما يشير إلى وجود تأثير سلبي على تشكل العمود الفقري عندما يتم التعبير عن Utrophin بشكل مفرط.
يجب أن تساعد طرق التصوير الحالية في تحديد المتغيرات الجينية التي تحكم مورفولوجيا العمود الفقري1،16. يمكن تقييم مورفولوجيا العمود الفقري DD (أي رقيقة / فطر ، خيطي ، قصير ، متفرع ، انظر الشكل 2) من إسقاطات ثنائية الأبعاد مفردة للصور الجانبية للحبل العصبي البطني نظرا لأن معظم أشواك DD تتبنى اتجاها موجها بطنيا مميزا. في هذه المقارنات ، من الضروري استخدام نفس علامة الفلورسنت لكل حالة حيث يبدو أن الأنواع المورفولوجية الظاهرة للعمود الفقري تتأثر بطريقة وضع العلامات (على سبيل المثال ، MYR::mRuby مقابل لايف أكت::GFP). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ أن أشكال العمود الفقري ديناميكية ومن المحتمل أن تغير شكلها استجابة للإشارات الخارجية 2,16. وبالتالي ، من الضروري أيضا مقارنة أشكال العمود الفقري بين الأنماط الجينية في مراحل نمو مماثلة وفي ظل ظروف مماثلة.
يعد اتجاه الحبل البطني C. elegans أمرا حيويا للغاية للحصول على صورة دقيقة. يجب أن يكون كل من الحبال البطنية والظهرية على جانبي الحيوان مرئيين في نفس المستوى Z ، مما يشير إلى أن الدودة موجهة على جانبها (الشكل 1B). من الأفضل عدم جمع صور للديدان التي تتحرك أو تتلامس مع الديدان أو الفقاعات الأخرى بالقرب من الحبل البطني ، لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى تدهور صور العمود الفقري.
لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي ، يجب إعداد شرائح جديدة مباشرة قبل كل عملية استحواذ. من الأفضل تصوير الديدان الملامسة لألياف الغراء الرقيقة فقط مقابل. “كرات من الغراء تميل إلى تجفيف الديدان وتدهور الصورة (الشكل 4 ب). في التجربة الموضحة في الشكل 4، تنشط نبضة الضوء التي مقدارها 561 نانومتر مجال الرؤية بأكمله. لزيادة الدقة الزمنية والمكانية للكشف عن عابري Ca++ المحليين ، على سبيل المثال ، داخل أشواك DD الفردية ، يمكن استخدام ماسح ضوئي صغير galvo تم إعداده لخط الليزر 561 نانومتر لتحفيز منطقة أصغر من الاهتمام17.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم إجراء التصوير والتحليل على Imaris في المورد المشترك لتصوير خلايا فاندربيلت (CIRS) بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (CA68485 و DK20593 و DK58404 و DK59637 و EY08126). يتم دعم LSM 880 من خلال المنحة 1S10OD201630. تم إجراء التصوير على قرص دوار نيكون في مركز نيكون للتميز. نشكر جيني شافر ، مديرة CISR ، وبريان ميليس على التدريب والمناقشات الثاقبة وأعضاء مختبر بورنيت: ديلان بورنيت ، أيدان فينيكس ، ونيلاي تانيجا على المشورة. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة إلى DMM (R01NS081259 و R01NS106951) ومنحة جمعية القلب الأمريكية إلى ACC (18PRE33960581).
Materials
| All-trans retinal (ATR) | Sigma-Aldrich | R2500-100MG | Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson |
| diH2O | MilliQ | To prepare M9 buffer | |
| Ethanol 100% | Sigma | 64-17-5 | To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) | To immobilize animals for imaging dendritic spines | ||
| ImageJ | NIH | (Schindelin J et al., 2012) | Open source image processing software |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagents | 7758-11-4 | To prepare M9 buffer |
| Levamisole hydrochloride | Sigma | 16595-80-5 | To immobilize animals for imaging dendritic spines |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M63-500 | To prepare M9 buffer |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12542B | To mount animals for microscopy acquisition |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S369-500 | To prepare M9 buffer |
| NaCl | Fisher Chemical | S671-3 | To prepare M9 buffer |
| NIS Elements version 05.21 | Nikon | To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment) | |
| Polybeads carboxylate 0.05um microspheres | Polysciences, Inc | 15913-10 | To immobilize animals for imaging Ca++ transients |
| Prism | For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients | ||
| SeaKen ME agarose | Lonza | 50014 | To make agarose pads to mount animals for imaging |
| Super Glue | The gorilla company | To immobilize animals for imaging Ca++ transients | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 22-034-980 | To mount animals for microscopy acquisition |
| vaseline | Covidien | 8884430300 | To seal sample for confocal snapshots |
| Wax | Fisherbrand | 23-021-399 | Paraplast tissue embedding medium |
| Microscope for super-resolution imaging | |||
| LSM880 | Zeiss | ||
| AiryScan detector | Zeiss | ||
| Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm | |||
| Laser lines | |||
| Stage controller | |||
| Microscope for Nyquist image acquisition | |||
| A1R Confocal | Nikon | ||
| Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm | |||
| 488 nm, 16mW | |||
| 561 nm, 17mW | |||
| Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines | |||
| Spinning Disk Confocal | Nikon | ||
| Andor DU-897 EMCCD camera | |||
| Spinning disk Head CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm | |||
| 488 nm, 65mW | |||
| 561 nm, 86mW | |||
| 525 nm (+/- 18 nm) | |||
| 605 nm (+/- 35 nm) |
Referencias
- Sala, C., Segal, M. Dendritic Spines: The Locus of Structural and Functional Plasticity. Physiological Reviews. 94 (1), 141-188 (2014).
- Cuentas-Condori, A., et al. C. elegans neurons have functional dendritic spines. Elife. 8, 47918 (2019).
- Philbrook, A., et al. Neurexin directs partner-specific synaptic connectivity in C. Elegans. Elife. 7, 35692 (2018).
- Oliver, D., Alexander, K., Francis, M. M. Molecular Mechanisms Directing Spine Outgrowth and Synaptic Partner Selection in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Neuroscience. 12, 10-13 (2018).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- Ladt, K., Ganguly, A., Roy, S. Axonal actin in action: Imaging actin dynamics in neurons. Methods of Cell Biology. 131, 91-106 (2016).
- Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual color neural activation and behavior control with chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genética. 200 (4), 1029-1034 (2015).
- Mello, C., Kramer, J., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrahcormosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C . elegans Using Microinjection. Journal of Visualized Experiments. (18), e833 (2008).
- Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-specific expression profiling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developemntal Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
- Mccarter, J., Bartlett, B., Dang, T., Schedl, T. Soma – Germ Cell Interactions in Caenorhabditis elegans : Multiple Events of Hermaphrodite Germline Development Require the Somatic Sheath and Spermathecal Lineages. Developemntal Biology. 181 (2), 121-143 (1997).
- Driscoll, M. Mounting animals for observation with Nomarski DIC optics. WormBook. , (2008).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Hotulainen, P., Hoogenraad, C. C. Actin in dendritic spines connecting dynamics to function. Journal of Cell Biology. 189 (4), 619-629 (2010).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are They All the Same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Miller, D. M., Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121 (9), 2877-2886 (1995).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Ventral Nerve Cord of Caenorhadbitis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society. 275 (938), 327-348 (1976).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
- Huff, J. The Fast mode for ZEISS LSM 880 with Airyscan high-speed confocal imaging with super-resolution and improved signal-to-noise ratio. Nature Methods. 13, (2016).
- Jacquemet, G., Carisey, A. F., Hamidi, H., Henriques, R., Leterrier, C. The cell biologist’s guide to super-resolution microscopy. Journal of Cell Science. 133 (11), 240713 (2020).
