コラーゲンベースの足場を用いた神経芽細胞腫の3次元 in vitro 生体模倣モデル

1. 実験計画 注:各実験に必要な足場とセルの数は、実験の規模に依存し、実験計画に関するこのセクションのツールを使用して計算できます。 必要な足場の数細胞生物学の変化(細胞増殖や代謝など)の全体的な実験タイムラインと評価間隔を決定します。注:たとえば、実験期間は14日間で、細胞増殖の評価は7日ごとに行われます。したがって、実験時点は 1 日目、7 日目、14 日目であり、合計 3 つの時点が与えられます。 次に、各時点で適用する実験的アプリケーションの数を決定します。すべての時点で同じ分析を完了して、変化を監視してください。注:スキャフォールド上での細胞増殖の典型的な分析には、細胞生存率アッセイ、DNA定量、組織学的染色とイメージング、および遺伝子発現解析が含まれます。これらについては、セクション 5 で詳しく説明します。 例えば、適切なアッセイを用いた細胞生存率評価の後、DNA/RNA単離(5.1.11で説明)にスキャフォールドを再利用するなど、複数のダウンストリームアプリケーションに同じスキャフォールドを使用するタイミングを決定します。 アプリケーションごとに最低3つの生物学的複製物(例えば、細胞生存率とDNA定量用に3つの足場、組織学用に3つ、遺伝子発現解析用に3つ)を保管してください。これは時点ごとに 9 つのスキャフォールドに等しいため、3 つのタイム ポイントに 27 個のスキャフォールディングを使用することを計画します。 最後に、この数値に実験パラメータまたは条件の数を掛けます(例:複数の細胞株、初期播種密度、足場組成の評価)。注:このプロトコルでは、4つの異なる初期播種密度が1つの細胞株に対して評価されており、108(27の足場 x 4つの条件)の足場が必要でした。人為的ミスを考慮し、追加のカバレッジを与えるには、この数に~10%を追加します(たとえば、108個の足場が必要な場合は、120個の足場を準備します)。 必要なセルの数注:0日目に円筒形の足場(直径6 mm、高さ4 mm)に細胞を播種するには、20 μLの容量の細胞懸濁液が推奨されます。この20μLの細胞懸濁液あたりの細胞数は、セクション1.1で計算された実験計画に従って調整されます。一般的な初期播種密度は、20μLあたり2×105 細胞であり、以下のプロトコルの例として使用されます。実験に必要な細胞の総量を計算するには、20 μLあたり最初の2×105 細胞に、必要な足場の数を掛けます。注:例えば、30個の足場に20 μLを掛けると、総容量は600 μLになります。各足場が2×105細胞を必要とする場合、600μLの懸濁液は合計6×10 6細胞(2×105×30)を含み、600μL中に6×106細胞の最終的な必要量を与える。実験パラメータの数によって、必要な細胞の総数が決まります。したがって、このプロトコルでは、従来の175 cm2フラスコ10個と同じ数の細胞を処理できる多層細胞培養フラスコを使用して細胞培養の概要を説明します。 2. コラーゲンベースの足場の作製 注:Coll-I-nHAおよびColl-I-GAG円筒形足場(直径6 mm、高さ4 mm)は、確立された方法15、21、27を使用して準備されます。以前に発表された方法17に従って化学的に架橋されたら、足場は1週間以内に使用する必要があります。 目的の機械的特性を備えた足場を製造した後、足場が完全に水和し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で完全に洗浄されていることを確認してください。注:これは通常、足場の架橋後~12時間かかり、4°Cの100 mL組織培養廃液容器で実施でき、容器あたり最大50個の足場と足場あたり2 mLのPBSで実行できます。 スキャフォールドをPBSで4°Cで保存し、使用する準備が整います。 3. 多層細胞培養フラスコで神経芽腫細胞を増殖させる 注意: 多層フラスコの最適な播種密度は異なります。この実験で使用したフラスコの場合、製造元の指示による最適密度は1 × 107セルです。多層フラスコを播種する前に、適切な組織培養フラスコ(例えば、T175cm2組織培養フラスコ)で1〜107細胞以上の×密度で細胞を増殖させる。細胞を多層フラスコ(セクション3.1)に播種するには、細胞を70〜80%のコンフルエントまで増殖させ、細胞カウントを実行するためのステップ3.2.16〜3.2.20を参照して、mLあたりの細胞数を収穫し、カウントします。細胞懸濁液を数えたら、すぐに多層フラスコの播種に進みます。細胞培養作業は、無菌性を維持するために層流フードで行う必要があります。 多層細胞培養フラスコの播種550 mLの完全増殖培地(使用する細胞株によって異なります)と100 mLの滅菌PBSを37°Cのウォーターバスで20分間予温します。 回収した細胞懸濁液を用いて、式(1)を用いて、1×107細胞の最適な播種密度を達成するために必要な細胞懸濁液の必要量を計算します(WANTは多層フラスコの播種に必要な細胞数、HAVEは細胞懸濁液中の細胞数/mLを指します)。(1)例えば。 予熱した増殖培地100mLに、必要な量の細胞懸濁液を加えます。 フードに新しい多層フラスコを取り、キャップを取り外して、フラスコを60°の角度で保持します。細胞懸濁液100 mLすべてをフラスコにゆっくりとピペットで移し、ネックの角度の付いた側を下ります。フラスコに蓋をして横に置き、細胞が層全体に均等に分散できるようにします。 60°の角度で、予熱した増殖培地400 mLを、ネックの角度のついた側にゆっくりと注ぐかピペッティングして、多層フラスコに加えます。首がいっぱいになった場合は、フラスコを直立位置に戻すか、フラスコに蓋をして横に置いてから注ぎに戻します。注意: 過度の気泡形成を避けるために、ゆっくりと注いでください。フラスコを直立位置で軽くたたいて、すべての気泡が上部に浮き上がるようにし、10 mLピペットで取り除きます。フラスコが首の底の糸まで満たされていることを確認します。これを実現するには、必要に応じて培地を追加します。 多層フラスコに蓋をし、角度のついた首を下に向けて、37°C、5%CO2、湿度95%でインキュベートします。 2〜3日ごとに成長をチェックし、コンフルエントを確認します。多層フラスコの下部2層のコンフルエントを確認するには、倒立顕微鏡の4倍対物レンズで観察します。注:10×7 個の神経芽腫細胞を播種した場合、10層フラスコがコンフルエントになるまでに通常1週間かかりますが、これは使用する細胞株によって異なる場合があります。 多層フラスコ内の細胞の定期メンテナンス550 mLの完全増殖培地(使用する細胞株によって異なります)、50〜100 mLのトリプシン、および300 mLの滅菌PBSを37°Cのウォーターバスで20分間予温します。 多層フラスコの濃度が70〜80%であることを確認します。 多層フラスコを層流フードに入れ、使用済みの培地をフラスコから注いで廃棄します。最初に、フラスコを傾けて、媒体がエアダムを越えて廃棄物容器に注がれるようにします。注いでいる間、媒体がフラスコの角度の付いた首を流れ落ちるまで、フラスコを180°回転させます。フラスコをこの軸に沿って前後に回転させて、残っている液体を取り除きます。 予熱した滅菌PBS100 mLを斜めのネックにゆっくりと加えて細胞を洗浄します。フラスコに蓋をして横に置き、PBSが均一に分布するようにし、フラスコを前後に回転させて細胞を洗浄します。 PBS洗浄は3.2.3と同じ要領で廃棄してください。洗浄手順を繰り返します。 予熱したトリプシン 50 mL を、予熱した滅菌 PBS 50 mL で希釈します。希釈したトリプシン溶液100 mLを多層フラスコに加え、キャップをしてフラスコを横にして置き、トリプシンが均一に分布するようにします。細胞株の接着性が高い場合は、100 mLの希釈されていないトリプシンを使用します。 フラスコを37°C、5%CO 2、湿度95%で2〜5分間インキュベートし、顕微鏡下で細胞剥離をモニタリングします。必要に応じて、フラスコをしっかりと叩いて取り外しを助けるか、インキュベーターにさらに1分間戻します。 多層フラスコを層流フードに入れ、100 mLの成長培地でトリプシンを中和します。フラスコに蓋をして横に置き、前後に揺らして完全に中和します。 中和した細胞懸濁液を4 x 50 mLのコニカル遠心チューブに注ぎます。注:完全な細胞回収が必要な場合は、多層フラスコを100 mLの滅菌PBSで再度洗浄し、2 x 50 mL遠心分離チューブに注ぎます。 細胞懸濁液を50mL遠心チューブで340×gで3〜4分間遠心分離し、細胞をペレット化します。 遠心分離管を層流フードに戻し、各ペレットからできるだけ多くの上清を慎重に廃棄します。注意: ペレットは大きく、比較的緩いため、簡単に破壊される可能性があります。 各ペレットに1〜5 mLの成長培地を加え、ピペッティングで数回上下させて再懸濁します。 再懸濁した4つのペレットを1本の50 mL遠心チューブにプールし、ピペットで完全に混合し、総量を記録します。 血球計算盤の各外側の正方形に30〜100個の細胞が含まれるように、細胞カウント用の細胞懸濁液を適切に希釈します。注:適切な開始希釈は1:100です。このために、10 μLの細胞懸濁液を新しい15 mLのコニカル遠心チューブにピペットで移し、990 μLの滅菌PBSで希釈します。混合物を上下に数回ピペットで移し、完全に混合します。 細胞ストックの入った50 mL遠心チューブをインキュベーターに入れながらカウントします。 きれいな血球計算盤を取り出し、 図2に示すように、きれいなカバーガラスをグリッドの上に置きます。 希釈した細胞懸濁液10μLを血球計算盤チャンバーにピペットで移します。10 μLの分注がすべて完了する前にチャンバーが満杯になった場合は、ピペッティングを中止してください。 血球計算盤を光学顕微鏡の4倍対物レンズの下に置きます。粗い焦点と細かい焦点を調整して、セルを視覚化します。 図 2 で強調表示されているように、チャンバーの外側の 4 つの角の正方形のセルの数を数えます。4 つのカウントを加算し、4 で割って、正方形あたりの平均セルを計算します。 図2:血球計算盤を用いた細胞カウント。 10マイクロリットルの細胞懸濁液をカバーガラスの下の血球計算盤に加えます。次に、チャンバーを顕微鏡の4倍対物レンズの下に置き、グリッドの外側の4つの角にある細胞の数をカウントします。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 平均カウントに希釈倍率(例:100)を掛け、この数に10,000を掛けて、式(2)を用いてmLあたりの細胞数を求めます。 (2) ストック溶液中の細胞の総数を掛けて計算します(例えば、プールした4つの再懸濁ペレットが20 mLの溶液になった場合は、細胞/mLに20を掛けます)。 多層フラスコを維持するには、ステップ3.1.2で概説した式(1)を使用して、1〜107 個の細胞をフラスコに戻すのに必要な細胞ストックの量を計算し×ステップ3.1.3-3.1.6を実行してフラスコを再播種します。スキャフォールドをシードする準備ができたら、次のセクションに進みます。 4. 足場に神経芽腫細胞を播種する ストックセル懸濁液の調製注:このプロトコルは各密度間の2の増倍係数のneuroblastomaのセルの4つの播種密度を作成するためのステップを、概説する。したがって、段階希釈を使用して、ストック懸濁液からさらに3つの細胞懸濁液を作成します。細胞培養作業は、無菌性を維持するために層流フードで行う必要があります。式(3)を使用して、多層フラスコ内の細胞の総数(セクション3.2.19でカウント)から必要な細胞の体積を計算し、最初の播種密度または細胞ストック懸濁液を調製します。(3)注:例えば、30個の足場に必要な足場あたり最大播種密度が6×10個の5細胞であり、各足場に20 μLの細胞懸濁液が供給される場合、ストック細胞懸濁液には、総容量600 μL(20 μL×30個の足場)で1.8 × 107個の細胞(6 × 105細胞×30個の足場)が必要です。この調製物から段階希釈を行うため、これらの数を2倍に、すなわち、1200μLの総容量で3.6×107 細胞にする必要があります。これをmLあたりの細胞数でWANTに変換するには、3.6 × 107 を1200 μLで分割し、1000 μLを掛けて、1 mLあたり3 × 107 細胞を得る。​ 必要な量の細胞ストックを滅菌済み2 mLまたは15 mL遠心チューブに添加し、増殖培地で最終容量を1200 μLにします。このチューブに「Density 1」というラベルを付けます(図3)。 段階希釈を実行して、複数の播種密度細胞懸濁液を作成します。ステップ 4.1.1 で調製した密度 1 から、図 3 のように段階希釈によりさらに 3 つの密度の細胞懸濁液を調製します。 増殖培地で各密度を2倍に希釈します。まず、必要な最終容量(前の例では600 μL)の増殖培地を3本の滅菌済み2 mLまたは15 mL遠心分離チューブに加えます。 密度 1 の半分(600 μL)をチューブの 1 つに移し、細胞懸濁液を培地と完全に混合して希釈します。このチューブに 密度 2 というラベルを付けます。 密度2の半分(600μL)を次のチューブに移し、細胞懸濁液を培地と完全に混合して希釈します。このチューブに密度 3 というラベルを付けます。 密度3の半分(600 μL)を次のチューブに移し、細胞懸濁液を培地と完全に混合して希釈します。このチューブに密度 4 というラベルを付けます。 密度 4 から 600 μL を廃棄し、4 つの調製物すべての最終容量が 600 μL になるようにします。 ネガティブコントロールとして、600 μLの増殖培地を滅菌済みの2 mL遠心チューブにのみ添加します。段階希釈プロセスの概略図については、 図3 を参照してください。 図3:細胞ストックを段階希釈して、4つの異なる足場播種密度の4つの懸濁液を調製 。(A)数は、足場当たりの所望の播種密度に合うように調整することができ、(B)密度当たりの足場の総数を掛けて、各足場に20μLの細胞懸濁液を投与する。この例では、密度 1 は、30 個の足場に対して 600 μL 中の 1.8 ×× 10 7 個の細胞に相当する、1 つの足場あたり 6 つの 10 個の5 個の細胞 を必要とします。この数を2倍にして段階希釈を開始し、600 μLを次のチューブの600 μLの増殖培地で移し、希釈します。このプロセスは、それぞれの間に係数が2の4つの細胞懸濁液が存在するまで続きます。ネガティブコントロールは、600 μLの培地をチューブにのみ添加することによって行われます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 スキャフォールドへの細胞懸濁液の添加注意: スキャフォールド(PBSで保管)を冷蔵庫から取り出し、室温(RT)に戻してからセルを追加します。PBSの足場を層流フードに運びます。 滅菌ピンセットを使用して、ウェルごとに1つの足場を持つ非接着性の24ウェルプレートに足場を配置します(図1C)。足場の角をそっと持ち上げ、容器の側面に軽く押し付けて、余分なPBSを取り除きます。足場をウェルの中央にスキン側を下にして追加します(足場の光沢のある層側で、プラスチック製の24ウェルプレートに下向きにします)。 24ウェルプレートに、細胞株の詳細、関連するパラメーター(播種密度など)、および時点を標識します。一度に1つの細胞播種密度で作業し、残りの密度は使用準備が整うまで37°Cインキュベーターで保持します。 層流フードで、P20ピペットと滅菌チップを使用して、関連する細胞懸濁液20 μLを各足場の中央に静かに添加します(図1D)。細胞を足場に加えながらよく混合することにより、細胞を懸濁液中に完全に保持します。懸濁液が足場の上に留まり、ウェルの底部に滑り落ちないようにしてください。 細胞を添加したら、プレートを3〜5時間(37°C、5%CO2、湿度95%)インキュベートして、ほとんどの細胞が付着できるようにします。 インキュベーション後、予熱した増殖培地1 mLを各ウェルにゆっくりと静かに添加します(図1E)。P1000ピペットを使用して培地を追加すると、よりゆっくりと制御された動きが可能になり、足場のずれが防止されます。非常に多くの足場を扱う場合は、ピペットガンを「ドロップ」と「ロー」に設定した10 mLピペットを使用します。 24ウェルプレートを一晩(37°C、5%CO2、湿度95%)インキュベートします。 足場上のセルのメンテナンス細胞接着の最初の24時間後(1日目)、播種した足場を新しい非接着性の24ウェルプレートに移し、1〜2 mLの新鮮な増殖培地を加えます。注:このステップでは、プラスチック製の24ウェルプレートの底に落ちた細胞を、足場上で成長させるのではなく、除去します。1日目として指定された足場複製は、セクション5で説明したように、24時間後に削除されます。したがって、メンテナンスはこれらの足場には適用されません。 最初に2〜3日ごとに足場を監視して、増殖培地の色が変化しないようにします。時間が経ち、足場内で細胞が増殖するにつれて、細胞に餌を与えることがより頻繁になります。 10 mLのピペットガンを使用し、スローモードで使用済みの培地の1 mLを取り除き、廃棄します。馴化培地を必要とする実験を行う場合は、使用済みの生物学的複製培地を15 mLの遠心チューブに回収し、340 × g で2分間遠心分離して細胞破片をペレット化し、上清を新しいチューブに移し、-80°Cで保存します。 予熱した増殖培地2 mLを、ピペットのドリップ機能を使用してスキャフォールドに静かに添加し、24ウェルプレートをインキュベーター(37°C、5%CO2、湿度95%)に戻します。培地が所望の成長期間にわたって費やされるたびに繰り返します。 5. 足場の回収と応用 注:各時点で、いくつかのアプリケーションを使用して、足場上の細胞増殖をモニターしたり、遺伝子およびタンパク質の発現プロファイルを評価したりできます。スキャフォールドの回収条件は、実行する分析によって異なり、複数の検索方法を次のサブセクションで概説し、 図 4 に示します。 足場内の細胞生存率の評価0.2 μmの滅菌フィルターでろ過し、層流フード内の遠心チューブに適切な細胞生存率アッセイ試薬を滅菌します。この滅菌溶液を、完全増殖培地および滅菌PBSとともに37°Cのウォーターバスで予熱します。 層流フードで、滅菌ピンセットを使用して、分析する足場を新しい24ウェルプレートに移します。プレートに関連するすべての詳細をラベル付けします。注: 解析は 3 回に分けて実行してください。 予熱した増殖培地900 μLを各ウェルに加え、続いて100 μLの無菌細胞生存試薬を加えます。900 μLの培地と100 μLの無菌細胞生存試薬を足場のないウェルに添加して、ネガティブコントロールを含めます。プレートの蓋を元に戻し、プレートを~3分間静かに揺動させて、希釈した細胞生存率試薬をウェル全体に均等に分散させます。プレートを 37 °C、5% CO2、湿度 95% でインキュベートします。注:インキュベーション時間は、細胞株ごとに最適化する必要があります。製造元のガイドラインを参照してください。神経芽腫細胞株の場合、4〜6時間のインキュベーションが最適と思われます。 インキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出し、数秒間静かに揺動させます。 層流フードで、新しい半透明の 96 ウェルプレートを開きます。24ウェルプレートの各ウェルから、インキュベートした培地と試薬を96ウェルプレートの3つのウェルに100 μL/ウェルで移し、テクニカルトリプリケートを与えます。注:この転写により、24ウェルプレートのウェルに700 μLが残ります。 96ウェルプレートをアルミホイルで覆い、細胞生存率試薬を光から保護します。 残りの700 μLのウェル内容物を、24ウェルプレートの各足場から取り出して廃棄します。各足場を1 mLの滅菌PBSで2回洗浄します。注意: 足場からすべての色が取り除かれるわけではありません。これらのスキャフォールドは、0.1 M重炭酸ナトリウム(NaHCO3)溶液中の1 mLの1% Triton X-100に入れ、-80°Cで保存することにより、DNA定量などのさらなるアプリケーションに使用できます(セクション5.2、 図4Bを参照)。 層流フードから96ウェルプレートを取り外し、マイクロプレートリーダーを使用して波長570 nmおよび600 nmで各ウェルの吸光度を測定します。両方の波長の吸光度値を記録し、メーカーの指示に従って、細胞による細胞生存率試薬の減少率を計算します。 適切なソフトウェアを使用して、細胞生存率の結果をグラフ化し、統計的に解析します。生物学的三重値を入力してエラーバーを生成し、アッセイのばらつきを示します。 実験期間における細胞生存率の変化を調べるには、適切な生物統計ソフトウェアを使用して平均の多重比較を伴う一元配置分散分析(ANOVA)検定を実行します。 グラフ上の時点間の有意差をns(P>0.05)、*(P≤0.05)、**(P≤0.01)、***(P≤0.001)、および****(P≤0.0001)として示します。 図4:各時点での異なる分析のためのスキャフォールドの検索。 (A)細胞生存率解析のために3つのスキャフォールド複製を回収します。(B)次に、これらの足場をPBSで洗浄し、0.1 M NaHCO3中の1% Triton X-100に入れ、DNA定量のために-80°Cで保存することができます。(C)さらに3回の複製を10%PFAで15分間固定し、PBSで中和し、組織学的染色およびイメージングのために4°Cで保存します。(D)最後に、フェノール/グアニジンベースの細胞溶解試薬に3回複製を添加し、遺伝子発現解析のために-20°Cで保存します。略語:PBS =リン酸緩衝生理食塩水;PFA = パラホルムアルデヒド。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 足場内の細胞からのDNAの定量注:ステップ 5.1.7 の後の注に記載されているように、DNA 定量のためのスキャフォールドの回収には、スキャフォールドを 0.1 M NaHCO3 溶液中の 1 mL の 1% Triton X-100 を含む 2 mL 遠心分離チューブに入れ、その後 -80 °C で保存します。 DNA分析を行う前に、細胞を3回の凍結融解サイクルを経て神経芽腫細胞を適切に溶解し、定量のためにDNAを放出する必要があります。Triton X-100に保管したサンプルを-80°Cから取り出します。 サンプルを室温で1〜3時間、または解凍するまで放置します。 サンプルを10〜20秒間ボルテックスし、サンプルを-80°Cで18〜24時間、または完全に凍結するまで戻します。このプロセスを合計3回の凍結融解サイクルで繰り返します。 DNA収量を最大化するには、組織ライザーを使用して足場内の細胞を破壊します。Triton X-100の足場が入った2 mL遠心チューブに金属ビーズを入れ、チューブをアダプター内に置き、サンプルを50振動/秒で2〜3分間振とうします。注意: 金属ビーズがテーパー底チューブに詰まる可能性があるため、丸底の遠心チューブを使用してください。 Triton X-100 溶液中の DNA を蛍光二本鎖 DNA(dsDNA)染色試薬で定量し、マイクロプレートリーダーを使用して発光を測定します。製造元のガイドラインを参照してください。サンプルをトリスエチレンジアミン四酢酸(TE)バッファーで適切に希釈し、TE バッファーで段階希釈して 8 種類の dsDNA 標準試料を調製します(図 5)。 黒色不透明の 96 ウェルプレートで、各標準試料またはサンプル 100 μL を 3 回に分けてウェルに添加します。 蛍光 dsDNA 染色を TE バッファーで 200 倍に希釈し、マルチチャンネルピペットを使用して各標準試料/サンプルに 100 μL を加えます。プレートをアルミホイルで覆い、室温で5分間インキュベートします。 各ウェルの蛍光を 520 nm で測定し、記録します。メーカーのガイドラインに従って、各サンプル中のDNAの濃度を計算します。注:使用する細胞株について、細胞当たりのDNAの平均濃度がわかっている場合、DNA濃度値は、式(4)を用いて細胞数に変換することができる。(4) 適切なソフトウェアを使用して、DNA定量結果をグラフ化し、統計的に解析します。生物学的三重値を入力してエラーバーを生成し、アッセイのばらつきを示します。 実験期間中のDNA濃度/細胞数の変化を調べるには、適切な生物統計ソフトウェアを使用して平均を多重比較する一元配置分散分析検定を実行します。 グラフ上の時点間の有意差をns(P>0.05)、*(P≤0.05)、**(P≤0.01)、***(P≤0.001)、および****(P≤0.0001)として示します。 図5:検量線作成のための8種類のDNA標準試料の調製。 λDNA のストック溶液は 100 μg/mL で提供されます。これを TE バッファーで 50 倍に希釈し、2000 ng/mL で標準試料 A を調製します。次に、400 μL の A を 400 μL の TE バッファーを含むチューブ B に移します。次に、400 μL の B を C で 2 倍に希釈し、G. 標準 H は TE バッファーのみで構成されているため、DNA 濃度は 0 ng/mL になります。略語:TE = Tris-EDTA。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 組織学的染色のための足場の調製注:スキャフォールドは、免疫蛍光法(IF)用のホールスキャフォールドとして、または組織学的染色または免疫組織化学(IHC)用のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)スライスとして、顕微鏡およびイメージングの目的で固定および染色できます。これにより、足場内の細胞の浸透と分布を定性的に評価することができ、タンパク質の発現を評価するために使用できます。PBSに10%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を調製します。足場あたり最終容量 500 μL に十分な溶液があることを確認してください。 この溶液を37°Cで予熱し、500 μLを標識された2 mL遠心チューブに添加して、足場回収を行います。 非接着性の24ウェルプレートから足場を取り外し(ステップ4.4.4)、層流フードに入れます。 滅菌ピンセットを使用して、足場を10%PFAを含むラベル付き遠心チューブに移します。足場を PFA 溶液で 15 分間固定します。各チューブに 500 μL の PBS を添加して PFA を中和し、4 °C で保存します。 自動ティッシュプロセッサー用の足場を準備するには、4°Cからスキャフォールドを取り出し、ピンセットを使用して、関連するすべての詳細を鉛筆でラベル付けしたプラスチックカセットに入れます。すべてのカセットをティッシュプロセッサーの金属製容器に入れます。 Tissue Processorで12段階のプロトコルを開始し、足場を固定、脱水、除去し、パラフィンで一晩浸透させます。処理したサンプルが入ったカセットを回収します。 次に、足場をパラフィンワックスブロックに埋め込んで、足場を非常に薄いスライスに切り分けて染色します。注:足場をカセットから取り外してワックスに埋め込むときは、画像が撮影される角度に影響を与えるため、足場の向きを考慮することが特に重要です。これは、足場への細胞浸潤を評価する際に重要です。 ワックス埋め込み器とコールドプレートをオンにします。蓋を持ち上げてワックスのレベルを確認します。必要に応じて補充してください。 一度に1つのサンプルで作業し、カセットを開き、足場を取り外して、プラスチック金型の中央に配置します。 ホットワックスをサンプルに注ぎ、正しい向きが維持されていることを確認し、ワックスが固まる前に、必要に応じて温かいピンセットで調整します。型を満たすためにさらにワックスを注ぎます。 ラベルの付いたカセットの蓋をプラスチック型の上に置き、その上にワックスを追加します。型をコールドプレートに置き、ワックスを固めます。4°Cで一晩保存し、ミクロトミーの前にパラフィンワックスが完全に固化するようにします。 ミクロトミーの準備をするには、35°Cのウォーターバス、乾燥プレート、およびミクロトームをオンにします。 ホルダーに刃を差し込み、レバーを締めて固定します。 トリムと断面の厚さを設定します (通常、足場断面の場合は 5 mm)。 FFPE足場を金型から取り外し、ミクロトーム前面のホルダーに固定し、切片を切断する前にサンプルの端の周りの余分なワックスを慎重にトリミングします。 ミクロトームのレバーを回転させてワックスブロックへの切り込みを開始し、スムーズな動きを確保します。 リボン状の切片を一度に約3つの足場部分に集め、35°Cのウォーターバスにそっと入れてしわを取り除きます。ピンセットを使用して、ウォーターバス内で切片を静かに分離します。 ポリシンコーティングされたガラス顕微鏡スライドを使用して、各切片をウォーターバスから持ち上げて、切片がスライドの中央に来るようにします。各スライドに鉛筆でラベルを付けます。 スライドガラスを乾燥プレートの上または60°Cの乾燥オーブンに入れます。乾燥したら、4°Cで保存し、必要な組織学的染色またはIHC染色に進みます。 遺伝子発現解析のためのスキャフォールドの回収インキュベーターから非接着性の24ウェルプレートから足場を取り除き(ステップ4.4.4)、層流フードに入れます。 滅菌ピンセットを使用して、足場を新しいラベルの付いた2 mL遠心チューブに移します。 ドラフト内で、フェノール/グアニジンベースの細胞溶解試薬1 mLを各チューブに添加して、足場内の細胞を溶解し、高品質のRNAを回収できるようにします。 適切なキットを使用してRNA抽出を行う準備ができるまで、チューブを-20°Cで保管します。標準的な逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)17を用いて、足場内の細胞における遺伝子発現を評価します。