PCR טיפה דיגיטלית כדי לזהות מוטציות indels באוכלוסיות יתושים אנופלין מהונדס גנטית
Summary
פרוטוקול זה מספק את השלבים החל מיצוי DNA ועד לערך ניסיוני עבור PCR טיפה דיגיטלית (ddPCR), כולל ניתוח לזיהוי וכימות של אירועי הצטרפות קצה לא הומולוגיים (NHEJ) באתרי יעד לאחר מחשוף Cas9 המושרה על ידי gRNA ותיקון DNA. שימושים אחרים בשיטה זו כוללים יישומים כגון זיהוי פולימורפיזם ואימות וריאנט עריכת גנים.
Abstract
ההתקדמות האחרונה בגנומיקה של יתושים וטכנולוגיות הנדסה גנטית טיפחה צורך בשיטות מהירות ויעילות לאיתור וריאציות ממוקדות של רצף דנ”א בקנה מידה גדול. באופן ספציפי, זיהוי הוספות ומחיקות (indels) באתרים בעריכת גנים שנוצרו על-ידי CRISPR מדריך RNA (gRNA)/Cas9 בתיווך הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ) חשוב להערכת הנאמנות של mutagenesis ואת התדירות של שינויים לא מכוונים. אנו מתארים כאן פרוטוקול עבור PCR טיפה דיגיטלית (ddPCR) כי הוא מתאים היטב לניתוח NHEJ תפוקה גבוהה. בעוד ששיטה זו אינה מפיקה נתונים המזהים וריאציית רצף בודדת, היא מספקת הערכה כמותית של וריאציית הרצף בתוך אוכלוסייה. בנוסף, עם משאבים מתאימים, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בהגדרת מעבדה באתר שדה בקלות רבה יותר מאשר הדור הבא או רצף Sanger. ל-ddPCR יש גם זמן מהיר יותר לתוצאות מאשר לאחת מהשיטות הללו, המאפשר ניתוח מהיר ומלא יותר של שונות גנטית באוכלוסיות בר במהלך ניסויי שדה של אורגניזמים מהונדסים גנטית.
Introduction
כונני גנים יש פוטנציאל עצום לשלוט אוכלוסיות חרקים של רלוונטיות רפואית וחקלאית1,2,3,4,5. לדוגמה, מערכות כונן גנים המבוססות על גרעיני CRISPR Cas ו- RNAs מנחים (gRNAs) יכולות לשמש לשינוי אוכלוסיות יתושים וקטוריות על ידי החדרת תכונות המעניקות refractoriness לטפילי מלריה המובילים להעברה מופחתת ופחותמחלות 1,4,5. מערכת כונן הגנים מעתיקה את עצמה ואת התכונה הקשורה מכרומוזום הומולוגי אחד למשנהו בתאי הנבט הטרום-מיוטיים, וזה מבטיח שרוב הצאצאים יירשו את הכונן וייצרו את הפוטנציאל לשינוי אוכלוסין ארוך טווח ובר קיימא בתחום. עם זאת, חיסרון אחד של שיטות מבוססות Cas / gRNA הוא האפשרות של יצירת מוטציות הכנסה ומחיקה (indel) באמצעות תיקון DNA הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ), וכתוצאה מכך יצירת אללים עמידים בפני כונן, אשר כאשר הצטבר לתדר גבוה מספיק באוכלוסייה, יכול לעצור את מערכת הכונן מלהפיץ1,2,3,4 . פרוטוקול זה מפרט שיטה בעלת תפוקה גבוהה ואמינה שיכולה לקבוע את השכיחות ואת הכמות היחסית של מוטציות בלתי-יציבות, הן ברמת האוכלוסייה והן ברמה האישית, במהלך כונן גנים מבוסס Cas/gRNA.
שיטות רצף מהדור הבא (NGS) מספקות רזולוציית רצף שאין דומה לה. עם זאת, העלות והדרישות הטכניות הקשורות ל- NGS אוסרות על בדיקות שגרתיות ומגבילים את השימוש בה כשיטת תפוקה גבוהה להערכת indels6,7,8. שיטות כימות PCR מסורתיות שימשו זה זמן רב כהליך ההערכה הסטנדרטי עבור indels גנום; עם זאת, שיטות אלה הן עבודה אינטנסיבית, לקחת זמן רב כדי להשיג נתונים, ויש להם רמה גבוהה של שונות. PCR Digital-Droplet (ddPCR) הוכח כרגיש יותר בזיהוי מוטציות מאשר רצף Sanger ביישומים מסוימים ויש לו מגבלת זיהוי נמוכה יותר מאשר NGS ביישומים אחרים6,7,8,9. יתר על כן, העלות להערכת ערכת מדגם וזמן סיבוב להשגת תוצאות היא פחות יקרה ומהירה יותר, בהתאמה, עבור ddPCR מאשר רצף סנגר או NGS9. באמצעות מערכת בדיקה כפולה, הבדיקה של Drop-Off מזהה אללים של NHEJ בהתבסס על היעדר רצף מסוג פראי (WT) באתר החיתוך Cas9 המיועד ל- GRNA. ב-assay זה, אמפליך קצר כולל אתר החיתוך החזוי של מערכת מבוססת Cas / gRNA מוגבר עם זוג פריימר ספציפי. בדיקה פלואורסצנטית אחת נועדה להיקשר לאזור שמור של האמפליקון וגשוש פלואורסצנטי אחר מזהה את רצף WT של אתר החיתוך. בנוכחות אלל NHEJ, האחרון לא ייקשר אמפלייקון.
השימוש ב- ddPCR מספק את היכולת לעצב פריימרים למחיקות יעד, הבדלים והוספות של זוג בסיס יחיד, שיאפשרו יצירת פרופיל NHEJ באוכלוסיית יתושים9. בהתחשב בתכונות אטרקטיביות אלה, יצרנו פרוטוקול עבור ddPCR לזיהוי תפוקה גבוהה של indels שנוצרו ממערכת כונן גנים מבוססת Cas / gRNA יתושים.
Protocol
Representative Results
Discussion
PCR טיפה דיגיטלית היא שיטה יעילה כדי לקבוע את נוכחותם של אללים indel הנובעים מאירועי NHEJ במערכת כונן גנים מבוסס Cas / gRNA ומאפשר כימות של התדירות של אללים אלה אצל יחידים או אוכלוסיות. כמה שלבים של הפרוטוקול צריך להיות אחריו עם טיפול מיוחד כדי להשיג תוצאות אמינות. ראשית, מיצוי ה- DNA הגנומי צריך להתבצע בקפידה כדי להבטיח איכות גבוהה וכמות מספקת. מיצוי טוב יאפשר קביעה מדויקת של העתקי הגנום הפלוידים לכל תגובה. מניסיוננו, ערכה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים)סיפקה עקירות DNA באיכות גבוהה באופן עקבי. עם זאת, עקירות של יתושים בודדים יכול להוכיח להיות מאתגר במיוחד כמו גלולה DNA הופך להיות קשה לדמיין והוא יכול בקלות להישאב עם supernatant אם לא זהיר. שנית, פריימרים ובדיקות חייבים להיות מתוכננים בקפידה. לפני השלמת ניסוי ddPCR, ודא כי פריימרים מעוצבים לגרום מוצר PCR יחיד על ידי ביצוע תחילה PCR מסורתי ודמיון מוצר אחד באמצעות אלקטרופורזה ג’ל. יש גם לתכנן את בדיקת הייחוס FAM כך שהיא משלימה לרצף שמור ביותר. זה יבטיח זיהוי מדויק של אללים WT ברחבי אוכלוסייה מגוונת. שילובי פריימר /בדיקה עבור כל ניסוי ייחודי יהיו תנאי תרמוציקלר שונים, ומומלץ לייעל תנאים אלה באמצעות שיפוע תרמי.
קיימות שיטות אחרות לזיהוי התראות, כגון ריצוף Sanger או NGS. רצף סנגר מוגבל מכיוון שיש לו גבול נמוך יותר של זיהוי וכוח גילוי נמוך כדי לזהות גרסאות חדשניות. רצף סנגר הוא גם עבודה אינטנסיבית ואינו תפוקה גבוהה. בהשוואה לרצף של סנגר, ל- NGS אין את אותן מגבלות של רגישות נמוכה, כוח גילוי ותפוקה. יתרון נוסף של NGS הוא יכולתה לזהות מגוון מוטציות מפולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (SNPs) לסידור מחדש. עם זאת, NGS היא שיטה יקרה יותר וגוזלת זמן ביישום קביעת דליים הקשורים Cas9/gRNA מכיוון שיש רק אזור יעד אחד של עניין, והוא מתאים ביותר עבור ניתוחים גדולים יותר ברחבי הגנום. בהשוואה לשיטות הנ”ל, ddPCR הוא תפוקה גבוהה ויש לו זמן סיבוב מהיר. אם החומרים והמכשירים של ddPCR זמינים בתוך הבית, ניתן לעבד 96 דגימות תוך 1-2 ימים, מה שהופך אותו מתאים לניתוח מהיר של ניסויים גדולים של אורגניזמים שעברו שינוי ב- Cas9/ gRNA.
בעוד יתרונות רבים קיימים עבור ddPCR יש גם מגבלות. ראשית, ציוד ddPCR אינו זמין לעתים קרובות בסביבת מעבדה עצמאית. ציוד ddPCR עשוי להיות זמין באופן משותף במוסדות מחקר גדולים יותר, אך זה אינו מאפשר קלות של ייצור נתונים וניתוח מחוץ למוסד. שנית, בניגוד לחלופות, ddPCR אינו מספק את הרצפים הייחודיים הבודדים של מוטציות indel מזוהות. PCR טיפה דיגיטלית יספק את התדירות של מוטציות indel בתוך האוכלוסייה, אבל ללא הרצף, אי אפשר לקבוע אם indels הנוכחי נוטים יותר לשמר או לעכב את הפונקציה של הגן של עניין. שיטת ddPCR אולי מתאימה ביותר לנתח אוכלוסיות בר לאחר ניסוי שחרור שדה של אורגניזם כונן מבוסס Cas9 / gRNA מכיוון שהיא יכולה לקבוע ביעילות את תדירות הכניסה של הטרנסג’ן לאוכלוסייה הילידית ואת דור ההטבעות בתוך האוכלוסייה קרוב לזמן אמת. בשל זמן ההסתובבות המהיר של ddPCR, יהיה זה אפשרי לבצע דגימה ולנתח את האוכלוסייה באזור ניסוי שדה שבועי אם חומרים היו זמינים באופן מקומי. עלויות ההפעלה לרכישה, ייבוא והקמה של ציוד ddPCR יהיו גבוהות במעבדות מרוחקות, אך היתרונות של היכולת להעריך בקפדנות אוכלוסייה פראית כפי שהיא עוברת שינוי ממערכת כונן יצדיקו את העלויות.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המימון ניתן על ידי יוזמת מלריה של אוניברסיטת קליפורניה אירוויין. AAJ הוא פרופסור דונלד ברן באוניברסיטת קליפורניה, אירווין.
Materials
| Reagents | |||
| ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
| DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| EDTA (pH 8.0) | Invitrogen | AM9260G | |
| Ethanol, 200 Proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| Isopropanol (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | A416-500 | |
| Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| PCR-grade Water | Any certified PCR-grade water can be used | ||
| Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| Proteinase K 20 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| Materials | |||
| ddPCR 96-Well Plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| Droplet Generation Oil for probes | Bio-Rad | 1863005 | |
| Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes) | Sigma-Aldrich | N/A | Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Forward and Reverse oligonucleotide primers | Sigma-Aldrich | N/A | Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Equipment | |||
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well |
Referencias
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
- Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34, 78-83 (2016).
- Courtier-Orgogozo, V., Morizot, B., Boëte, C. Agricultural pest control with CRISPR-based gene drive: time for public debate: Should we use gene drive for pest control. EMBO Reports. 18 (6), 878-880 (2017).
- Carballar-Lejarazú, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553 (2020).
- Wang, Z., et al. Comparison of droplet digital PCR and direct Sanger sequencing for the detection of the BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 33 (6), 22902 (2019).
- Dong, L., Wang, S., Fu, B., Wang, J. Evaluation of droplet digital PCR and next generation sequencing for characterizing DNA reference material for KRAS mutation detection. Scientific Reports. 8 (1), 9650 (2018).
- Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR_Cas9 induced mutations using next-generation sequencing. BMC Genomics. 15 (1), 1002 (2014).
- Carballar-Lejarazú, R., Kelsey, A., Pham, T. B., Bennett, E. P., James, A. A. Digital droplet PCR and IDAA for the detection of CRISPR indel edits in the malaria species Anopheles stephensi. Biotechniques. 68 (4), 172-179 (2020).
- Holt, R. A., et al. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298 (5591), 129-149 (2002).
