Digital-Droplet PCR om indels mutaties in genetisch gemodificeerde anopheline muggenpopulaties te detecteren
Summary
Dit protocol biedt de stappen van DNA-extractie tot experimentele opstelling voor digitale druppel PCR (ddPCR), inclusief analyse voor de identificatie en kwantificering van niet-homologe end-joining (NHEJ) gebeurtenissen op doellocaties na gRNA-geïnduceerde Cas9-splitsing en DNA-reparatie. Andere toepassingen van deze methode zijn toepassingen zoals polymorfismedetectie en genbewerkingsvariantverificatie.
Abstract
Recente ontwikkelingen in muggengennomica en genetische manipulatietechnologieën hebben de behoefte aan snelle en efficiënte methoden voor het detecteren van gerichte DNA-sequentievariatie op grote schaal bevorderd. Met name het detecteren van inserties en deleties (indels) op gen-bewerkte plaatsen gegenereerd door CRISPR-gids RNA (gRNA) / Cas9-gemedieerde niet-homologe eindverbinding (NHEJ) is belangrijk voor het beoordelen van de betrouwbaarheid van de mutagenese en de frequentie van onbedoelde veranderingen. We beschrijven hier een protocol voor digital-droplet PCR (ddPCR) dat zeer geschikt is voor nhej-analyse met hoge doorvoer. Hoewel deze methode geen gegevens produceert die individuele sequentievariatie identificeren, biedt het een kwantitatieve schatting van de sequentievariatie binnen een populatie. Bovendien kan dit protocol met de juiste middelen gemakkelijker worden geïmplementeerd in een laboratoriumomgeving op veldlocatie dan de volgende generatie of Sanger-sequencing. ddPCR heeft ook een snellere doorlooptijd voor resultaten dan een van deze methoden, wat een snellere en volledigere analyse van genetische variatie in wilde populaties mogelijk maakt tijdens veldproeven met genetisch gemanipuleerde organismen.
Introduction
Gene drives hebben een enorm potentieel om insectenpopulaties van medische en agrarische relevantie te beheersen1,2,3,4,5. Genaandrijvingssystemen op basis van CRISPR Cas-nucleasen en gids-RNA’s (gRNA’s) kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om vectormuggenpopulaties te wijzigen door eigenschappen te introduceren die refractie verlenen aan malariaparasieten, wat leidt tot verminderde overdracht en minder ziekte1,4,5. Het gene-drive systeem kopieert zichzelf en de bijbehorende eigenschap van het ene homologe chromosoom naar het andere in de pre-meiotische geslachtscellen, en dit zorgt ervoor dat de meerderheid van de nakomelingen de drive erft en het potentieel creëert voor langdurige en duurzame populatiemodificatie in het veld. Een nadeel van de cas/gRNA-gebaseerde methoden is echter de mogelijkheid om insertie- en deletie (indel) mutaties te genereren door middel van niet-homologe end-joining (NHEJ) DNA-reparatie, wat resulteert in het genereren van drive-resistente allelen, die wanneer ze zich ophopen tot een voldoende hoge frequentie in de populatie, kunnen voorkomen dat het aandrijfsysteem zichverspreidt 1,2,3,4 . Dit protocol beschrijft een high-throughput en betrouwbare methode die de prevalentie en relatieve hoeveelheid indel mutaties kan bepalen, zowel op populatie- als op individueel niveau, tijdens cas / gRNA-gebaseerde gene drive.
Next-generation sequencing (NGS)-methoden bieden een ongeëvenaarde sequencingresolutie. De kosten en technische vereisten in verband met NGS verbieden echter routinetests en beperken het gebruik ervan als een methode met hoge doorvoer om indels6,7,8te beoordelen. Traditionele PCR-kwantificeringsmethoden worden al lang gebruikt als de standaardevaluatieprocedure voor genoomindels; deze methoden zijn echter arbeidsintensief, duren lang om gegevens te verkrijgen en hebben een hoge mate van variabiliteit. Het is bewezen dat Digital-Droplet PCR (ddPCR) gevoeliger is voor het detecteren van mutaties dan Sanger-sequencing in sommige toepassingen en heeft een lagere detectielimiet dan NGS in andere6,7,8,9. Bovendien zijn de kosten voor het beoordelen van een steekproefset en de doorlooptijd voor het verkrijgen van resultaten respectievelijk goedkoper en sneller voor ddPCR dan Sanger-sequencing of NGS9. Met behulp van een dual-probe-systeem identificeert de Drop-Off-test NHEJ-allelen op basis van de afwezigheid van wild-type (WT) -sequentie op de gRNA-gerichte doel Cas9-cut-site. In deze test wordt een korte amplicon inclusief de voorspelde snijplaats van het Cas/gRNA-gebaseerde systeem versterkt met een specifiek primerpaar. Eén fluorescerende sonde is ontworpen om te binden aan een geconserveerd gebied van het amplicon en een andere fluorescerende sonde herkent de WT-sequentie van de snijplaats. In aanwezigheid van een NHEJ-allel zal dit laatste niet binden aan het amplicon.
Het gebruik van ddPCR biedt de mogelijkheid om primers te ontwerpen om deleties, verschillen in enkele basenparen en inserties te targeten, waardoor NHEJ-profilering in muggenpopulatieanalyses mogelijk wordt9. Gezien deze aantrekkelijke eigenschappen hebben we een protocol voor ddPCR gemaakt voor high-throughput detectie van indels gegenereerd uit een op Cas /gRNA gebaseerd gene-drive systeem in muggen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Digital-droplet PCR is een efficiënte methode om de aanwezigheid van indel allelen als gevolg van NHEJ-gebeurtenissen in een op Cas/gRNA gebaseerd gene-drive systeem te bepalen en maakt het mogelijk om de frequentie van deze allelen in individuen of populaties te kwantificeren. Sommige stappen van het protocol moeten met speciale zorg worden gevolgd om betrouwbare resultaten te bereiken. Ten eerste moet de genomische DNA-extractie zorgvuldig worden uitgevoerd om een hoge kwaliteit en voldoende kwantiteit te garanderen. Een goede extractie maakt een nauwkeurige bepaling van de haploïde genoomkopieën per reactie mogelijk. Onze ervaring was dat een in de handel verkrijgbare kit (zie Tabel met materialen)consistent hoogwaardige DNA-extracties leverde. Extracties van individuele muggen kunnen echter bijzonder uitdagend blijken te zijn, omdat de DNA-pellet moeilijk te visualiseren wordt en gemakkelijk kan worden opgezogen met het supernatant als het niet voorzichtig is. Ten tweede moeten primers en sondes zorgvuldig worden ontworpen. Voordat u het ddPCR-experiment voltooit, moet u ervoor zorgen dat de ontworpen primers resulteren in een enkel PCR-product door eerst een traditionele PCR uit te voeren en een enkel product te visualiseren via gel-elektroforese. De referentie FAM-sonde moet ook zo zijn ontworpen dat deze complementair is aan een sterk geconserveerde sequentie. Dit zorgt voor nauwkeurige detecties van WT-allelen in een diverse populatie. De primer/probe combinaties voor elk uniek experiment zullen verschillende thermocycler condities hebben, en het wordt aanbevolen om die omstandigheden te optimaliseren met behulp van een thermische gradiënt.
Er bestaan andere methoden voor het identificeren van indels, zoals Sanger-sequencing of NGS. Sanger-sequencing is beperkt omdat het een ondergrens van detectie en een laag detectievermogen heeft om nieuwe varianten te identificeren. Sanger sequencing is ook arbeidsintensief en is geen high-throughput. In vergelijking met Sanger-sequencing heeft NGS niet dezelfde beperkingen van lage gevoeligheid, detectievermogen en doorvoer. Een ander voordeel van NGS is het vermogen om een verscheidenheid aan mutaties te detecteren, van single nucleotide polymorphism (SNP’s) tot herschikkingen. NGS is echter een duurdere en tijdrovendere methode bij de toepassing van het bepalen van Cas9 / gRNA-geassocieerde indels omdat er slechts één doelgebied van belang is en het het meest geschikt is voor grotere genoombrede analyses. In vergelijking met de bovengenoemde methoden is ddPCR een hoge doorvoer en heeft het een snelle doorlooptijd. Als de ddPCR-materialen en -instrumenten in eigen huis beschikbaar zijn, kunnen 96 monsters binnen 1-2 dagen worden verwerkt, waardoor het zeer geschikt is voor snelle analyse van grote proeven met Cas9 / gRNA-gemodificeerde organismen.
Hoewel er veel voordelen zijn voor ddPCR, zijn er ook beperkingen. Ten eerste is de ddPCR-apparatuur niet vaak beschikbaar in een onafhankelijke laboratoriumomgeving. ddPCR-apparatuur kan gemeenschappelijk beschikbaar zijn bij grotere onderzoeksinstellingen, maar dit maakt het niet mogelijk om gegevens te genereren en te analyseren buiten de instelling. Ten tweede biedt ddPCR, in tegenstelling tot de alternatieven, niet de individuele unieke sequenties van geïdentificeerde indelmutaties. Digitale druppel PCR zal de frequentie van indelmutaties binnen een populatie leveren, maar zonder de sequentie kan men niet bepalen of de aanwezige indels meer kans hebben om de functie van het betreffende gen te behouden of te remmen. De ddPCR-methode is misschien het meest geschikt om wilde populaties te analyseren na een veldafgifteproef van een op Cas9 / gRNA gebaseerd aandrijforganisme omdat het efficiënt de frequentie van introductie van het transgen in de inheemse populatie en de generatie van dedels binnen de populatie in bijna realtime kan bepalen. Vanwege de snelle doorlooptijd van ddPCR zou het mogelijk zijn om wekelijks monsters te nemen en de populatie in een veldproefregio te analyseren als materialen lokaal beschikbaar waren. De opstartkosten voor de aanschaf, import en installatie van de ddPCR-apparatuur zouden hoog zijn in afgelegen laboratoria, maar de voordelen van het rigoureus kunnen beoordelen van een wilde populatie terwijl deze wordt aangepast door een aandrijfsysteem, zouden de kosten rechtvaardigen.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiering werd verstrekt door de University of California Irvine Malaria Initiative. AAJ is een Donald Bren Professor aan de Universiteit van Californië, Irvine.
Materials
| Reagents | |||
| ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
| DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| EDTA (pH 8.0) | Invitrogen | AM9260G | |
| Ethanol, 200 Proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| Isopropanol (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | A416-500 | |
| Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| PCR-grade Water | Any certified PCR-grade water can be used | ||
| Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| Proteinase K 20 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| Materials | |||
| ddPCR 96-Well Plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| Droplet Generation Oil for probes | Bio-Rad | 1863005 | |
| Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes) | Sigma-Aldrich | N/A | Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Forward and Reverse oligonucleotide primers | Sigma-Aldrich | N/A | Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Equipment | |||
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well |
Referencias
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
- Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34, 78-83 (2016).
- Courtier-Orgogozo, V., Morizot, B., Boëte, C. Agricultural pest control with CRISPR-based gene drive: time for public debate: Should we use gene drive for pest control. EMBO Reports. 18 (6), 878-880 (2017).
- Carballar-Lejarazú, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553 (2020).
- Wang, Z., et al. Comparison of droplet digital PCR and direct Sanger sequencing for the detection of the BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 33 (6), 22902 (2019).
- Dong, L., Wang, S., Fu, B., Wang, J. Evaluation of droplet digital PCR and next generation sequencing for characterizing DNA reference material for KRAS mutation detection. Scientific Reports. 8 (1), 9650 (2018).
- Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR_Cas9 induced mutations using next-generation sequencing. BMC Genomics. 15 (1), 1002 (2014).
- Carballar-Lejarazú, R., Kelsey, A., Pham, T. B., Bennett, E. P., James, A. A. Digital droplet PCR and IDAA for the detection of CRISPR indel edits in the malaria species Anopheles stephensi. Biotechniques. 68 (4), 172-179 (2020).
- Holt, R. A., et al. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298 (5591), 129-149 (2002).
