数字液滴PCR检测转基因按蚊种群中的Indels突变

1. 基因提取 制备EDTA/核裂解缓冲液（EDTA/NLS），每个样品的比例为500μLNLS和120μLEDTA。放大多个样品。将混合物在冰上冷却。注意：冷却后，溶液将在2-5分钟内变云，具体取决于体积。 使用机械均质器在装有600μL冷冻EDTA / NLS的1.5 mL微量离心管中均质灭蚊样品10-15秒;彻底混合。 将17.5μL20mg / mL蛋白酶K加入试管中并充分混合。 在55°C下孵育过夜。 或者，将样品在55°C下孵育3小时，摇动并每1小时涡旋样品。 向室温样品中加入200μL蛋白质沉淀溶液，并剧烈涡旋20 s。 将样品在冰上冷却5分钟。 将样品离心至15，890 RCF沉淀蛋白质4分钟。 小心地吸出含有DNA的上清液，并将其转移到含有600μL异丙醇的清洁的1.5mL微量离心管中。 通过倒置管5-10次轻轻混合溶液。在15，890 RCF下离心1分钟。小心地倾析上清液，同时保留DNA沉淀。 加入600μL室温70%乙醇。通过轻轻倒置管来洗涤造粒的DNA。 在15，890 RCF下离心1分钟。使用玻璃移液器吸头小心地除去上清液。 将管倒置到干净的吸水纸上，并将沉淀风干10-15分钟。 用PCR级水重悬DNA。每个蚊子样品使用20μL，或100μL用于10个混合蚊子。注：使用市售试剂盒（见 材料表）的蚊子样品的DNA提取方法改编自制造商的从组织培养细胞和动物组织中分离基因组DNA方案。 2. ddPCR反应及液滴生成制备 使用荧光计定量DNA。注意：对于滴定测定，建议每次反应使用3，000-30，000单倍体基因组拷贝的范围，其设计用于使用HEX标记探针检测NHEJ事件，该探针与靶切位点的WT序列结合，并且在靶位点存在缺失或插入时不会退火（滴落）， 表示存在 NHEJ 变体。 使用单倍体基因组重量和提取物中DNA的浓度计算拷贝数。这是通过将提取的DNA的浓度乘以用于获得总DNA质量的体积，然后将其除以单倍体基因组重量来完成的。确保添加的体积在1-10μL之间，根据需要稀释以达到推荐的单倍体基因组拷贝范围。注意：一 个冈比亚按蚊 单倍体基因组估计为每只成年蚊子10 0.27pg 。 设计引物和探针。设计引物熔化温度（Tm）在55-60°C范围内的前向和反向寡核苷酸引物，其位于gRNA靶位点的5’和3’末端，产生150-400 bp的扩增子。 用于NHEJ检测的HEX（六氯荧光素）标记探针：设计一个长度约为15-20 bp的寡核苷酸，与靶位点互补，并将HEX探针添加到5’端，将BHQ1（BLack Hole Quencher 1）添加到3’端。水解探针的Tm应比引物的Tm高3-10°C。 FAM（6-羧基荧光素）标记的探针供参考WT：设计长度约为15-20 bp的寡核苷酸，与远离靶位点（约25 bp）的保守基因组位点互补，并将FAM探针添加到5’末端，BHQ1添加到3’末端。水解探针的Tm应比引物的Tm高3-10°C。 3. PCR反应制备 用以下组分制备25μLdPCR样品混合物：用于探针的ddPCR超级混合物（无UTP）：12.5μL，正向和反向引物（10μM）：每个1μL，HEX / FAM探针（10μM）：每个0.625μL，DNA：1-5μL（3，750-37，500单倍体基因组拷贝）和水：高达25μL。 通过涡流或回流移液（上下）（20x）彻底混合反应。注意：如果反应在96孔板中，请上下移取整个体积20次，而不是涡旋以避免气泡形成。 短暂离心样品以将混合物沉降在管底部或孔中。注意：确保反应在室温下产生液滴。为每个墨盒中的额外/未使用的孔准备1x的ddPCR混合物（每个墨盒有8个孔）。 4. 液滴生成 使用50μL多通道移液器，将20μL的ddPCR样品混合物加载到墨盒的中间行（图1A，顶部）。 将70μL油装入底排。将20 μL的1x ddPCR超混液加载到未使用的孔中。注意：不要引入气泡。 将垫片仅接触边缘，避免中心凹陷区域（图1B）。 将板牢固地放入液滴发生器中，然后合上盖子以开始运行。 使用多通道移液器，将40μL的表液混合物从墨盒的顶排（图1A，底部）转移到96孔板中。 以45-30°的角度绘制液体样品3-5秒。将混合物以45°角缓慢排出超过3秒到井的侧面，使其从侧面滴落。可以去移液器的第二站（完全排出）以排出所有液体。 使用箔热封，在180°C下密封板5秒。 5. 聚合酶链反应 将密封的板放入热循环器（图1C）中，并设置推荐的PCR条件，如果遵循NHEJ滴定指南如下： 在95°C下初始变性10分钟。 设置40个循环，在94°C下30秒变性，55°C1分钟退火，60°C2分钟延伸。 在98°C下保持10分钟。 保持在4°C。注：特定引物和探针组的退火温度可以使用热梯度进行优化。所有步骤均使用 2 °C/s 的斜坡速率。应根据每个实验设计和设置调整PCR条件。 6. 液滴读数 将板牢固地放在液滴读取器中，在左上角有孔A-1（平滑的角，其他三个边缘）（图1D）。 在程序中设置板：将FAM指定为已知的参考通道，将HEX指定为未知通道（图2A）。 以直接定量方式运行液滴读取实验。运行完成后，将分析的”实验类型”更改为”丢弃（DOF）”（图2A）。 第7章 分析 指定正确的实验参数（图2A）：样品信息，SuperMix，目标名称（WT或NHEJ），目标类型（参考或未知），信号Ch1（HEX或FAM），信号Ch2（HEX或FAM），并手动设置液滴计数阈值（建议高于10，000以获得可靠的结果）。该软件将使用指定的参数执行大部分分析。 检查”液滴”选项卡中的液滴计数;确保所有值都高于 10，000（图 2B）。 检查 1 D 幅度，确保从负极中有效分离信号。 在”板编辑器”中，突出显示整个板并将”实验类型”设置为”丢弃”。 将WT目标设置为 参考，为FAM指定通道1，为HEX指定通道2。 将 NHEJ 目标设置为未知，将通道 1 指定为 FAM，将通道 2 指定为无。 在”2D 振幅”选项卡中，使用图形工具为每个样本设置聚类阈值。考虑与WT集群相关的尾部;这对于NHEJ测定是正常的（图3A）。注意：在”比率”选项卡下，单击图表右上角的齿轮图标。选择分数丰度。该图现在将绘制一个与NHEJ事件百分比相对应的点（图3B）。