Оптический пинцет для изучения РНК-белковых взаимодействий в регуляции трансляции

Передача генетической информации от ДНК к белкам через мРНК – сложный биохимический процесс, который точно регулируется на всех уровнях посредством макромолекулярных взаимодействий внутри клеток. Для трансляционной регуляции РНК-белковые взаимодействия играют решающую роль в быстрой реакции на различные раздражители и ^{сигналы1,2}. Некоторые РНК-белковые взаимодействия влияют на стабильность мРНК и тем самым изменяют время, в течение которого РНК является трансляционно активной. Другие РНК-белковые взаимодействия связаны с механизмами перекодирования, такими как стоп-кодон, обход или запрограммированное рибосомное сдвиги кадра (PRF)3,4,5,6,7. Недавно было продемонстрировано, что ряд РНК-связывающих белков (RBP) взаимодействуют со стимулирующими элементами мРНК и механизмом трансляции, чтобы диктовать, когда и сколько перекодирования произойдет в клетке7,8,9,10,11. Таким образом, чтобы проанализировать роль РНК-связывающих белков в трансляции и то, как они модулируют структуру и стабильность РНК, важно детально изучить принципы взаимодействия и механические свойства этих РНК-белковых комплексов.

Десятилетия работы заложили основу для изучения многоступенчатого и многокомпонентного процесса трансляции, который опирается на сложную связь между РНК и белковыми компонентами механизма трансляции для достижения скорости и точности12,13,14. Следующим важным шагом в понимании сложных регуляторных событий является определение сил, временных шкал и структурных детерминант во время трансляции с высокой точностью12,15,16,17. Изучение конформационной динамики РНК и особенно того, как трансдействующие вспомогательные факторы действуют на структуру РНК во время трансляции, было дополнительно освещено появлением одномолекулярных инструментов, включая оптические пинцеты или волноводы нулевого ^{режима16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26}.

Оптический пинцет (OT) представляет собой высокоточный одномолекулярный метод, который был применен для изучения многих видов РНК-зависимых динамических процессов, включая транскрипцию и трансляцию26,27,28,29,30,31,32. Использование оптического пинцета позволило детально исследовать молекулярные взаимодействия, структуры нуклеиновых кислот и термодинамические свойства, кинетику и энергетику этих процессов16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Оптический пинцет основан на захвате микроскопических объектов сфокусированным лазерным лучом. В типичном эксперименте с ОТ интересующая молекула привязана между двумя прозрачными (обычно полистирольными) шариками (рисунок 1А)²⁷. Эти бусины затем захватываются оптическими ловушками, которые ведут себя как пружины. Таким образом, сила, приложенная к молекуле, может быть рассчитана на основе смещения шарика от центра сфокусированного лазерного луча (центра ловушки). В последнее время оптический пинцет был объединен с конфокальной микроскопией (рисунок 1B), что позволяет проводить флуоресценцию или измерения резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET)40,41,42. Это открывает совершенно новую область возможных экспериментов, позволяющих одновременно измерять и, следовательно, точно соотносить данные силовой спектроскопии и флуоресценции.

Здесь мы демонстрируем эксперименты с использованием оптического пинцета в сочетании с конфокальной микроскопией для изучения белково-РНК-взаимодействий, регулирующих трансляционное смещение кадра. Между объективом и конденсатором проточная ячейка с пятью каналами обеспечивает непрерывное применение пробы с ламинарной подачей. Через микрофлюидные каналы различные компоненты могут быть введены напрямую, что уменьшает практическое время, а также позволяет очень мало потреблять образец на протяжении всего эксперимента.

Во-первых, предлагается базовое руководство, помогающее в разработке экспериментов ОТ, и обсуждаются преимущества, а также подводные камни различных установок. Далее описывается подготовка образцов и экспериментальные рабочие процессы, а также предоставляется протокол анализа данных. Чтобы представить пример, мы излагаем результаты, полученные в результате экспериментов по растяжению РНК для изучения элементов РНК, изменяющих кадр SARS-CoV-2 (рисунок 2A) с трансдействующим фактором короткой изоформой противовирусного белка цинк-пальца (ZAP), который изменяет трансляцию вирусной РНК из альтернативного кадра считывания43. Кроме того, показано, что флуоресцентно-меченые рибосомы могут быть использованы в этом конфокальном анализе ОТ, который был бы полезен для мониторинга процессивности и скорости машины перевода. Метод, представленный здесь, может быть использован для быстрого тестирования эффекта различных буферов, лигандов или других клеточных компонентов для изучения различных аспектов трансляции. Наконец, обсуждаются распространенные экспериментальные подводные камни и способы их устранения. Ниже изложены некоторые важные моменты в экспериментальном проектировании.

Проектирование конструкций
В принципе, существует два общих подхода к созданию OT-совместимой конструкции РНК. Первый подход использует длинную молекулу РНК, которая гибридизуется с комплементарными ручками ДНК, что дает конструкцию, состоящую из двух гибридных областей РНК/ДНК, фланкирующих одноцепочечную последовательность РНК посередине (рисунок 2B). Этот подход используется в большинстве экспериментов с ОТ РНК33,44,45.

Второй подход использует преимущества дескрипторов dsDNA с короткими (около 20 нт) ^{свесами15,17}. Эти выступы затем гибридизуются с молекулой РНК. Несмотря на более сложную конструкцию, использование дескрипторов dsDNA преодолевает некоторые ограничения гибридной системы ДНК/РНК. В принципе, могут быть реализованы даже очень длинные ручки (>10кб), что более удобно для конфокальных измерений. Кроме того, молекула РНК может быть лигирована на ручки ДНК для повышения стабильности троса.

Стратегия конечной маркировки
Конструкция должна быть привязана к бусинам посредством сильного молекулярного взаимодействия. Хотя существуют подходы к ковалентному связыванию ручек с ^{бусинами46}, сильные, но нековалентные взаимодействия, такие как стрептавидин-биотин и дигоксигенин-антитело, обычно используются в экспериментах OT15,33,35,45. В описанном протоколе конструкция маркирована биотином или дигоксигенином, а шарики покрыты стрептавидином или антителами против дигоксигенина соответственно (фиг.1А). Этот подход был бы пригоден для приложения сил примерно до 60 пН (на трос)⁴⁷. Кроме того, использование различных стратегий маркировки 5′ и 3′ позволяет определить ориентацию троса, образованного между ^{бусинами17}.

Маркировка белка для измерения флуоресценции
Для конфокальной визуализации существует несколько широко используемых подходов к флуоресцентной маркировке. Например, флуорофоры могут быть ковалентно присоединены к аминокислотным остаткам, которые находятся в белках или вводятся сайт-направленным мутагенезом через реакционноспособную органическую группу. Тиоловые или амино-реактивные красители могут быть использованы для маркировки остатков цистеина и лизина соответственно. Существует несколько обратимых методов защиты для повышения специфичности ^{маркировки48,49}, однако нативные белки обычно маркируются несколькими остатками. Хотя небольшой размер флуорофора может дать преимущество, неспецифическая маркировка может влиять на активность белка и, таким образом, интенсивность сигнала может ^{варьироваться49}. Также в зависимости от эффективности маркировки интенсивность сигнала может отличаться в разных экспериментах. Поэтому перед экспериментом следует выполнить проверку активности.

В случае, если интересующий белок содержит N- или C-концевую метку, такую как His-tag или strep-tag, специфическая маркировка этих меток представляет собой другой популярный подход. Кроме того, маркировка, нацеленная на метки, снижает вероятность вмешательства флуорофора в активность белка и может повысить ^{растворимость49}. Тем не менее, маркировка, специфичная для метки, обычно дает монофлуорофорные меченые белки, которые может быть трудно обнаружить. Другой способ специфической маркировки может быть достигнут путем использования антител.

Настройка микрофлюидики
Сочетание ОТ с системой микрофлюидики позволяет быстро переходить между различными экспериментальными условиями. Кроме того, современные системы используют преимущества поддержания ламинарного потока внутри проточной ячейки, что исключает смешивание жидкостей из других каналов в перпендикулярном направлении относительно направления потока. Поэтому ламинарный поток особенно выгоден для экспериментального проектирования. В настоящее время обычно используются проточные ячейки с 5 каналами (рисунок 3).