النمذجة السكتة الدماغية في الفئران: الآفات القشرية البؤرية عن طريق Photothrombosis
Summary
الموصوف هنا هو نموذج السكتة الدماغية الضوئية ، حيث يتم إنتاج السكتة الدماغية من خلال الجمجمة سليمة عن طريق تحفيز انسداد الأوعية الدموية الدقيقة الدائمة باستخدام إضاءة الليزر بعد إدارة صبغة حساسة للضوء.
Abstract
السكتة الدماغية هي السبب الرئيسي للوفاة وإعاقة البالغين المكتسبة في البلدان المتقدمة. على الرغم من التحقيق المكثف للاستراتيجيات العلاجية الجديدة ، لا تزال هناك خيارات علاجية محدودة لمرضى السكتة الدماغية. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من البحوث للمسارات المرضية مثل التهاب ما بعد السكتة الدماغية ، وتولد الأوعية ، واللدونة العصبية ، والتجديد. ونظرا لعدم قدرة النماذج المختبرية على إعادة إنتاج تعقيد الدماغ، فإن نماذج السكتة الدماغية التجريبية ضرورية لتحليل وتقييم أهداف الأدوية الجديدة لهذه الآليات وتقييمها لاحقا. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة ماسة إلى نماذج موحدة مفصلة لجميع الإجراءات للتغلب على ما يسمى بأزمة النسخ المتماثل. كجهد داخل اتحاد أبحاث ImmunoStroke ، يتم وصف نموذج ماوس فوتوثرومبوتيك موحد باستخدام حقنة داخل الصفاق من روز البنغال وإضاءة الجمجمة السليمة بليزر 561 نانومتر. يسمح هذا النموذج بأداء السكتة الدماغية في الفئران مع تخصيصها لأي منطقة قشرية في الدماغ دون جراحة جراحية غازية. وبالتالي، تمكين دراسة السكتة الدماغية في مناطق مختلفة من الدماغ. في هذا الفيديو ، يتم عرض الطرق الجراحية لتحريض السكتة الدماغية في النموذج الضوئي جنبا إلى جنب مع التحليل النسيجي.
Introduction
لا تزال السكتة الدماغية السبب الرئيسي للوفاة وإعاقة البالغين المكتسبة في البلدان المتقدمة فيالقرن الحادي والعشرين والتي تسبب ما يقرب من 2.7 مليون حالة وفاة في عام 2017 في جميع أنحاء العالم1. حتى مع الجهود الهائلة التي يبذلها المجتمع العلمي ، لا تتوفر سوى القليل من العلاجات. وعلاوة على ذلك، مع مثل هذه المعايير الاستبعاد عالية، وهذه الخيارات محدودة بالفعل ليست في متناول العديد من المرضى، مما أدى إلى حاجة ملحة لعلاجات جديدة لتحسين الانتعاش الوظيفي بعد السكتة الدماغية.
وبالنظر إلى عدم قدرة النماذج المختبرية على تكرار التفاعلات المعقدة للدماغ، فإن النماذج الحيوانية ضرورية لأبحاث السكتة الدماغية قبل السريرية. الفئران هي النموذج الحيواني الأكثر استخداما في مجال أبحاث السكتة الدماغية. وتهدف غالبية هذه النماذج الماوس للحث على احتشاءات عن طريق منع تدفق الدم داخل الشريان الدماغي الأوسط (MCA) منذ تقع غالبية الآفات السكتة الدماغية البشرية في إقليم MCA2. على الرغم من أن هذه النماذج تلخص بشكل أفضل آفات السكتة الدماغية البشرية ، إلا أنها تنطوي على عمليات جراحية ملتصقة مع تباين كبير في حجم العقائد.
منذ روزبلوم واقتراح الصبان من نموذج photothrombotic في 19773, وتطبيق هذا النموذج في وقت لاحق للفئران واتسونوآخرون. نموذج السكتة الدماغية الضوئية يحفز احتشاء القشرية المحلية والمحددة نتيجة لphotoactivation صبغة حساسة للضوء حقن سابقا في تدفق الدم. وهذا يسبب تجلط الأوعية المحلية في المناطق المعرضة للضوء. لفترة وجيزة ، عند التعرض للضوء من الصبغة الحساسة للضوء المحقونة ، يتم تحريض الإصابة التأكسدية الموضعية لغشاء الخلية البطانية ، مما يؤدي إلى تجميع الصفائح الدموية وتشكيل الجلطة ، يليها اضطراب محلي لتدفق الدم الدماغي7.
تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في بساطتها في التنفيذ وإمكانية توجيه الآفة إلى المنطقة المرغوبة. على عكس نماذج السكتة الدماغية التجريبية الأخرى ، هناك حاجة إلى خبرة جراحية طفيفة لأداء نموذج السكتة الدماغية الضوئية حيث يتم تحريض الآفة من خلال إضاءة الجمجمة السليمة. وعلاوة على ذلك، فإن الحدود المحددة جيدا(الشكل 2A والشكل 5B)والمرونة للحث على الآفة إلى منطقة معينة في الدماغ يمكن أن تسهل دراسة الاستجابات الخلوية داخل المنطقة القشرية الإقفارية أو السليمة8. لهذه الأسباب، وهذا النهج هو مناسبة لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية من اللدونة القشرية.
على مدى العقود القليلة الماضية ، والقلق المتزايد بشأن عدم إعادة الإنتاج بين مجموعات البحوث قد صاغ ما يسمى أزمة النسخ المتماثل9. بعد تنسيق أول دراسة تجريبية متعددة المراكز معشاة قبل السريرية في عام 201510، وهي أداة مقترحة لتحسين الأبحاث قبل السريرية11و12و13، تم التأكيد على أن أحد أسباب عدم الاستنساخ بين الدراسات قبل السريرية من مختبرات مستقلة هو عدم وجود توحيد كاف لنماذج السكتة الدماغية التجريبية ومعلمات النتائج14. وبناء على ذلك، عندما تم تأسيس اتحاد ضربة المناعة (https://immunostroke.de/)، وهو تعاون يهدف إلى فهم التفاعلات بين الدماغ والمناعة الكامنة وراء المبادئ الميكانيكية لاستعادة السكتة الدماغية، كان توحيد جميع نماذج السكتة الدماغية التجريبية بين كل مجموعة بحثية أمرا أساسيا.
وصف هنا هو الإجراء الموحد لتحريض نموذج فوتوثروثوتيك كما هو مستخدم في اتحاد البحوث المذكورة أعلاه. لفترة وجيزة، خضع التخدير، تلقى حقنة روز البنغال (10 ميكرولتر / ز) داخل الصفاق، والجمجمة سليمة، 3 ملم اليسار من bregma، أضاءت على الفور من قبل ليزر 561 نانومتر لمدة 20 دقيقة (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، يتم الإبلاغ عن طريقة الهسطولوجيا والسلوكية ذات الصلة لتحليل نتائج السكتة الدماغية في هذا النموذج. وتستند جميع الأساليب على إجراءات التشغيل القياسية التي وضعت واستخدمت في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف البروتوكول المقدم نموذج السكتة الدماغية التجريبي لداء الخلايا الضوئية من خلال إضاءة الجمجمة السليمة بالليزر 561 نانومتر ، مع حقنة سابقة داخل الصفاق من روز البنغال. وحتى وقت قريب، كان استخدام هذا النموذج منخفضا ولكنه آخذ في الازدياد باطراد.
الوفيات أثناء تحريض السكتة ال?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جميع شركائنا في التعاون في اتحادات ضربة المناعة (FOR 2879 ، من الخلايا المناعية إلى استرداد السكتة الدماغية) على الاقتراحات والمناقشات. تم تمويل هذا العمل من قبل دويتشه Forschungsgemeinschaft (DFG، مؤسسة البحوث الألمانية) في إطار استراتيجية التميز الألمانية في إطار مجموعة ميونيخ لطب الأعصاب النظم (EXC 2145 SyNergy – الهوية 390857198) وبموجب المنح LI-2534/6-1، LI-2534/7-1 و LL-112/1-1.
Materials
| 561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
| Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
| Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
| Forceps | FST | 11616-15 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
| Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
| Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
| Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Xylacine | Albrecht |
Referencias
- GBD 2016 Causes of Death Collaborators. Global, regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental Neuro Therapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).
- Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circulation Research. 40 (3), 320-328 (1977).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Bergeron, M. Inducing photochemical cortical lesions in rat brain. Current Protocols in Neuroscience. , (2003).
- Lee, J. K., et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surgical Neurology. 67 (6), 620-625 (2007).
- Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathologica. 72 (4), 315-325 (1987).
- Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50370 (2013).
- McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Bath, P. M., Macleod, M. R., Green, A. R. Emulating multicentre clinical stroke trials: a new paradigm for studying novel interventions in experimental models of stroke. International Journal of Stroke: Official Journal of the INternational Stroke Society. 4 (6), 471-479 (2009).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 94-99 (2010).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, 271-279 (2016).
- Gnyawali, S. C., et al. Retooling laser speckle contrast analysis algorithm to enhance non-invasive high resolution laser speckle functional imaging of cutaneous microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048 (2017).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice – middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e511729 (2014).
- Cramer, J. V., et al. In vivo widefield calcium imaging of the mouse cortex for analysis of network connectivity in health and brain disease. Neuroimage. 199, 570-584 (2019).
- Heindl, S., et al. Automated morphological analysis of microglia after stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17 (7), 642-651 (2018).
- Rust, R., et al. Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).
- Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies. Archives of Neurology. 59 (12), 1870-1873 (2002).
- Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope. Journal of Neuroscience Methods. 170 (1), 35-44 (2008).
