Productie van recombinante PRMT-eiwitten met behulp van het Baculovirus Expression Vector System

OPMERKING: Het overzicht van de bevs-protocolstappen wordt beschreven in figuur 1. 1. Generatie van een recombinant bacmide DNA Voorbereiding van LB agar selectieve platen voor DH10Bac transformatie Bereid LB-agarplaten voor die: 50 μg/ml kanamycine, 7 μg/ml gentamicine, 10 μg/ml tetracycline, 200 μg/ml Bluo-gal en 40 μg/ml IPTG bevatten om te selecteren voor DH10Bac-transformatiemiddelen. Weeg 25 g voorgemengde LB bouillon en 13 g Bacto Agar en doe in een kolf van 2 L. Breng het volume op 1 L met gedestilleerd water en autoclaaf gedurende 15-30 minuten bij 121 °C. Zet een waterbad op 50 °C en koel de autoclaaf agar oplossing in het waterbad gedurende 40-60 minuten totdat het is afgekoeld tot 50-55 °C. Voeg aan de gekoelde oplossing gentamicine toe aan een eindconcentratie van 7 μg/ml, kanamycine aan een eindconcentratie van 50 μg/ml, tetracycline aan een eindconcentratie van 10 μg/ml, Bluo-gal aan een eindconcentratie van 200 μg/ml en IPTG aan een eindconcentratie van 40 μg/ml. Meng de agar-oplossing en aliquot 7-10 ml van het medium tot elke plaat van 60 mm met behulp van een pipet van 50 ml. Laat de platen op kamertemperatuur (2 uur) zitten om uit te harden. Omkeren, wikkelen en bewaren bij 4 °C. Platen met antibiotica zijn tot 4 weken stabiel. Transformatie van de plasmide in DH10Bac E. coli competente cellen Bereken het vereiste volume competente cellen. Ontdooi competente cellen op ijs, draai zachtjes naar beneden en resuspend terug door zachtjes te tikken. Gebruik een 12-kanaals pipet om 4 μL van de cellen in elke put van de 96-put PCR-plaat te doseren. Voeg ~ 0,3-0,5 μg recombinant plasmide-DNA toe aan de competente cellen en meng voorzichtig door te tikken. Incubeer het mengsel gedurende 10-15 minuten op ijs. Schok het mengsel in een PCR-machine bij 42 °C gedurende 45 s. Koel op ijs gedurende 2 minuten. Verdeel 0,5 ml SOC-medium over elke put van de blokken met 96 putten (96-diepe put 2,4 ml). Gebruik een 12-kanaals pipet om de getransformeerde bacteriële suspensie over te brengen in de overeenkomstige put van het blok en bedek deze met een luchtporeplaat. Plaats het blok in een schudincubator op 37 °C met middelmatige agitatie (205 tpm) gedurende 4-5 uur. Verdeel 30-50 μL van de cultuur gelijkmatig over het oppervlak van de LB-agarplaat met steriele glasparels. Bewaar de rest van de cultuur bij 4 °C. Incubeer de platen bij 37 °C totdat de kleur van de blauw/witte kolonies waarneembaar is (40-48 uur). Gooi de cultuur weg wanneer er voldoende witte, grote kolonies op de plaat worden verkregen. Om ervoor te zorgen dat witte kolonies alleen recombinant bacmid DNA bevatten, moet één geïsoleerde witte kolonie opnieuw op verse LB-agarplaten met antibiotica, bluo-gal en IPTG worden gestreeld om het fenotype te verifiëren. Incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C. Kies een geverifieerde witte kolonie uit een opnieuw gestreepte plaat voor de extractie van recombinant bacmid DNA. Isoleren van recombinant bacmide DNA Ent een enkele, geïsoleerde witte kolonie in 3 ml LB medium aangevuld met 50 μg/ml kanamycine, 7 μg/ml gentamicine en 10 μg/ml tetracycline in 24-putblokken (24-putblokken rond de bodem) en dek af met een luchtporevel. Groei ‘s nachts bij 37 °C met schudden bij 250 tpm. Centrifugeer de 24-putblokken gedurende 10 minuten op 2.100 x g. Decanteer het supernatant, keer het blok om en tik zachtjes op een absorberend tissuepapier. Voeg 250 μL oplossing 1 (celreanipatieoplossing) toe aan elke put. Sluit de blokken af met tapepads of andere afdichtingsfolies en plaats ze gedurende 5-10 minuten op een schudplatform bij 75 tpm. Controleer elke put om een goede cellysis te garanderen en resuspend indien nodig, met behulp van een tip van 1 ml. Voeg 250 μL oplossing 2 (cellysisoplossing) toe aan elke put, sluit de blokken af en plaats ze gedurende 30 s op een schudplatform bij 75 tpm (om kruisbesmetting van de monsters te voorkomen, 24-putblokken niet omkeren) gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 250 μL oplossing 3 (neutralisatieoplossing) toe, sluit de blokken af en plaats deze gedurende 30 s op het schudplatform bij 75 tpm. Een dikke witte neerslag van eiwit en E. coli genomisch DNA zal zich vormen. Leg het monster 10-15 minuten op ijs. Centrifugeer gedurende 60 min bij 2.100 x g bij 4 °C om het witte neerslagmateriaal stevig te pelleteren. Label tijdens het centrifugeren een nieuwe microcentrifugebuis en voeg 0,8 ml absoluut isopropanol toe. Breng het supernatant voorzichtig over op de buis met isopropanol, vermijd wit neerslagmateriaal. Meng door de buis een paar keer voorzichtig om te keren en plaats vervolgens 5 tot 10 minuten op ijs. In dit stadium kan het monster ‘s nachts bij -20 °C worden bewaard. Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 14.000 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en voeg 0,5 ml 70% ethanol toe aan elke buis. Keer de buis meerdere keren om om de pellet te wassen. Centrifugeer gedurende 5 min bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. (Optioneel: herhaal wassen) Breng monsters in de laminaire stromingskap om de steriliteit van het plasmidepreparaat te garanderen en verwijder zoveel mogelijk van het supernatant.OPMERKING: De pellet kan losraken van de bodem van de buis, dus let goed op de pellet bij het weggooien van het supernatant. Droog de pellet 15 – 20 minuten aan de lucht in de laminaire stromingskap en los het DNA op in 50 μL gefilterde elutiebuffer, 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 (zorg ervoor dat pellets niet te droog zijn). Aangezien recombinant bacmid DNA groter is dan 135 kb, om afschuiven van DNA te voorkomen, lost u de pellet op door zachtjes te tikken. Om de aanwezigheid van het gen van belang in bacmid DNA te verifiëren, stelt u de PCR-reactiemix in een 96-put PCR-plaat in. Bereid het PCR-mengsel als volgt voor: 1 μL buffer, 0,2 μL (elk 10 mM) dNTPs, 0,1 μL Taq DNA-polymerase, 0,1 μL (25 μM) voorwaartse en omgekeerde primers (BACV2FWD: tattccggattattcataccg; BACV2REV: ctctacaaatgtggtatggc), 1 μL bacmide DNA en 8 μL water. Voer versterking van de doelgenen uit met initiële denaturatie gedurende 2 minuten bij 95 °C, gevolgd door 25 cycli van 94 °C gedurende 30 s, 55 °C voor 30 s en 72 °C gedurende 1 min/kb. Beëindig de reactie na een laatste verlenging gedurende 7 min bij 72 °C. Analyseer 10 μL van het versterkingsproduct op 1% (m/v) agarosegel die nucleïnezuurkleuringsoplossing door elektroforese bevat. Bewaar de geverifieerde bacmid DNAs bij 4 °C. 2. Generatie van recombinante baculovirusvoorraden OPMERKING: Gebruik exponentieel groeiende Sf9-cellen met een levensvatbaarheid van 95% of meer voor elke stap van het baculovirusexpressieprotocol, inclusief celtransfectie voor baculovirusgeneratie, baculovirusvolumeversterking, eiwitexpressiescreening en eiwitproductie. Transfectie van Sf9-cellen met Bacmid DNA en transfectiereagentia (T.R.) zoals JetPrime of X-tremeGENE 9.OPMERKING: Trypan Blue-kleuring en een hemocytometer kunnen worden gebruikt om levensvatbare celtellingen en % cel levensvatbaarheid te bepalen. Niet-levensvatbare cellen nemen de vlek op en lijken blauw onder de microscoop, terwijl levensvatbare cellen niet worden aangetast. Om de levensvatbaarheid van de cel te berekenen, wordt een totaal aantal cellen verkregen (niet-besmet en gekleurd) en wordt het aantal levensvatbare cellen gedeeld door het totale aantal cellen en vermenigvuldigd met 100. Verdun de exponentieel groeiende Sf9-cellen tot een uiteindelijke celdichtheid van 4 x 105 cellen/ml in serumvrije insectenmedia en giet in het steriele reagensreservoir. Gebruik een programmeerbare meerkanaals pipet om 0,5 ml van de verdunde Sf9-cellen in elke put van een 24-putplaat te zaaien. Label een put van de plaat als een controle (niet-getransfecteerd) en gebruik het als een controle om de getransfecteerde en niet-getransfecteerde cellen te vergelijken om te beoordelen op mogelijke tekenen van infecties. Nadat u de cellen in de platen hebt gezaaid, schommelt u de platen voorzichtig meerdere keren heen en weer om een gelijkmatige monolaag van cellen te garanderen. Draai de platen niet omdat de cellen in het midden van de put clusteren. Incubeer de platen ten minste 1 uur bij 27 °C om celbevestiging aan de kweekplaten mogelijk te maken. Meng de transfectie reagens flacon goed door elkaar. Voeg voor elke transfectie 2 μL van het transfectiereagens toe aan 100 μL van de transfectiebuffer. Elk ander niet-aangevuld insectenmedium kan ook worden gebruikt. Deponeer het verdunde transfectiereagens in een steriel reagensreservoir en meng het voorzichtig gedurende 10 s. Breng met behulp van een 12-kanaals pipet 102 μL van het verdunde transfectiereagens over in een steriele 96-microwellplaat. Breng 10 μL van een 0,2 μg/μL-oplossing van recombinant bacmide-DNA over in de overeenkomstige put van een 96-wells microwell-plaat en meng door de plaat voorzichtig van de zijkanten te schudden (tikken). Incubeer het transfectiemengsel gedurende 15-20 minuten om complexe vorming mogelijk te maken. Voeg met behulp van een verstelbare 6-kanaals pipet die is ontworpen voor overdracht tussen 96- en 24-putplaten, de transfectiemix toe aan de cellen dropwise in overeenkomstige putten van transfectieplaten en incubeer gedurende 4-5 uur bij 27 °C. Schommel de platen tijdens de incubatietijd voorzichtig meerdere keren heen en weer om de gelijkmatige verdeling van het transfectiemengsel over de celmonolaag te garanderen. Voeg 4-5 uur na transfectie 1,5 ml insectenserumvrij medium toe, aangevuld met 10% (v/v) finale van warmte geïnactiveerd foetaal runderserum en antibioticum-antimycoticum tot 1% (v/v) eindvolume (100 eenheden/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine en 0,25 μg/ml ampère). Incubeer de cellen in een incubator van 27 °C gedurende 72-96 uur. Schommel indien mogelijk één keer per dag voorzichtig met de transfectieplaten. Zoek naar tekenen van infectie (SOI), duidelijk in getransfecteerde cellen bij 72-96 uur posttransfectie (Figuur 2). Houd er rekening mee dat de getransfecteerde cellen het virus gaan produceren en de cultuur verder infecteren; zoek dus naar de tekenen van infectie.OPMERKING: Tekenen van infectie zijn structurele veranderingen in de insectencellen, zoals een toename van 25-50% in de celdiameter, vergrote celkernen, gelijkmatig afgeronde vorm, verlies van proliferatie en aanhechting aan het oppervlak van de kweekschaal, evenals een afname van de levensvatbaarheid van de cel (Figuur 2. Baculovirus Geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde Sf9-cellen). 3. Kleinschalige eiwitexpressiescreening en virusversterking Infectie van Sf9-cellen met P1 baculovirusvoorraden.OPMERKING: 4-5 dagen na transfectie moeten tekenen van infectie zichtbaar zijn in de getransfecteerde cellen in vergelijking met de controlecellen (niet-overgetransfecteerde) cellen onder een omgekeerde microscoop. De eerste recombinante baculovirussen die in het celkweekmedium worden uitgescheiden, moeten klaar zijn om te verzamelen. Zaad 2 x 105 exponentieel groeiende Sf9-cellen in serumvrije insectenmedia in elke put van de 24-putplaten in een totaal volume van 2 ml voor infectie met P1-virussen om het virusvolume te versterken (resulterend in de generatie van de P2-virussen). Nadat u de cellen in de platen hebt gepijpt, wiegt u de platen voorzichtig met heen en weer om een gelijkmatige monolaag te garanderen. Draai de platen niet omdat de cellen in het midden van de put clusteren. Incubeer de platen ten minste 1 uur op 27 °C om cellulaire hechting aan de plaat mogelijk te maken. Doseer 4 ml Sf9-cellen met een dichtheid van 3,5-4 x 106 in insectenserumvrij medium in elke put van 24-putblokken om te infecteren met P1-virussen voor de eiwitexpressiescreening.OPMERKING: Label een put van de 24-put platen en 24-well blokken als controle en gebruik als een niet-geïnfecteerde controle voor vergelijking van geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen bij het zoeken naar SOI. Gebruik een programmeerbaar elektronisch meerkanaalskanaals om gelijktijdige verzameling van P1-virussen (stap 2.1.13), infectie van vers gezaaide Sf9-cellen (stap 3.1.1) en infectie van de suspensiecellen in de 24-putblokken (stap 3.1.4) met 150 μL P1-virussen mogelijk te maken. Draai de rest van de verzamelde P1 virale voorraden gedurende 15 minuten bij 17.970 x g,breng ze over in microcentrifugebuizen en bewaar ze in het donker bij 4 °C. Schommel de 24-putplaten (stap 3.1.1) voorzichtig op een zuigerschudder om een gelijkmatige verdeling van de toegevoegde P1-virussen over de celmonolaag te garanderen; herhaal dit een paar keer tijdens de incubatietijd. Bedek de 24-putblokken met de suspensiecultuur van geïnfecteerde Sf9-cellen (stap 3.1.4) met een luchtporiënvel. Incubeer de 24-putblokken bij 27 °C en schud bij 245 tpm gedurende 72-96 uur. Zoek naar SOI binnen 72-96 uur na infectietijd in de 24-putplaten met P2-virussen (stap 3.1.1) en in de 24-putblokken (stap 3.1.4) met geïnfecteerde cellen voor de expressiescreening.OPMERKING: 4-5 dagen na infectie van Sf9-cellen met P1-virussen moet SOI duidelijk zijn in de geïnfecteerde cellen in vergelijking met de niet-geïnfecteerde controlecellen onder een omgekeerde microscoop. Verzamel P2-virussen uit 24-putplaten, centrifugeer gedurende 15 minuten bij 17.970 x g,breng ze over in microcentrifugebuizen en bewaar ze in het donker bij 4 °C. Spray na infectie na 72-96 uur over de 24-putblokken met 70% ethanol, breng in de laminaire stroomkap en controleer de celdichtheid en levensvatbaarheid in een paar putten door Trypan Blue-kleuring. Ga verder met eiwitzuivering als cellen tekenen van infectie hebben en de levensvatbaarheid bijna 70-75% is, zoals beoordeeld door Trypan Blue-kleuring. Pellet de cellen door de 24-putblokken gedurende 15 minuten bij 525 x g bij 4 °C te centrifugeren. Gooi het supernatant weg en strek de pellets grondig op in 1 ml lysisbuffer bestaande uit 25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,6 % NP-40, 2 mM imidazol, 5% glycerol (v/v) en 1x proteaseremmercocktail (100x proteaseremmercocktail bestaat uit aprotinine 0,25 mg/ mL E-64 0,25 mg/ml). Bewaar de celsuspensie bij -80 °C voor de daaropvolgende testzuivering (zie 3.2.2). Eiwitzuivering uit bevroren celsuspensie in 24-put testexpressieblokken. Montage van het bindblok (figuur 3). Plaats 3 overlappende lagen parafilm op de bovenkant van het 96-diepe putblok (96-diepe put 2,4 ml). Plaats een 96-put filterplaat (filter microplaat, 96-well, polypropyleen met 25 μm ultra hoog moleculair gewicht polyethyleen membraan) op de bovenkant van het 96-diepe putblok. Duw de filterplaat naar beneden om de uiteinden in de parafilm te zetten om de filterplaat van het 96-put diepe blok af te sluiten. Breng 50 μL voorgequilibreerde 50% Ni-NTA harsmest over in elke put van de filterplaat. Testexpressieprocedure Plaats de bevroren celophanging (stap 3.1.15) aanwezig in 24-putblokken in een waterbad bij RT gedurende 5-10 minuten en schud vervolgens bij 450 tpm gedurende 20 minuten. Centrifugeer de 24-putblokken gedurende 15 minuten op 3.275 x g. Breng met behulp van een meerkanaals pipet de ontruimde lysaten over in een filterplaat met 50 μL voorgequilibreerde 50% Ni-NTA harsmest (stap 3.2.1.4) en sluit de filterplaat af met een 96-put dopmat (96-put dopmat, voor gebruik met vierkante put, 2 ml).OPMERKING: Gebruik een paar elastiekjes om het bindblok bij elkaar te houden tijdens incubatie- en centrifugeerstappen. Plaats het beveiligde bindblok gedurende 45-60 minuten in een rotator in een koude ruimte om ontruimde lysaten met Ni-NTA-hars te incuberen. Til na incubatie de filterplaat voorzichtig op en verwijder de parafilmlaag van het oppervlak van het 96-diepe putblok (stap 3.2.1.1). Plaats de filterplaat terug op het 96-diepe putblok en draai het beveiligde bindblok 2 min naar beneden bij 235 x g. Was bond Ni-NTA hars 2x met 2 ml wasbuffer bestaande uit 25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% glycerol en 15 mM imidazol. Draai het blok elke keer gedurende 5 minuten met wasbuffer op 235 x g om volledige verwijdering van restvloeistof te garanderen. Breng de filterplaat over op de bovenkant van de 96-put PCR-plaat met 10 μL 4x laadkleurstof. Voeg 40 μL elutiebuffer (25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 5% glycerol, 500 mM imidazol) toe aan elke put van de filterplaat en incubeer gedurende 5 minuten. Draai het blok om eiwitten in de 96-well PCR-plaat te elute op 235 x g gedurende 10 minuten. Sluit de 96-put PCR plaat af met een hoge temperatuur bestendig tappad en verwarm bij 98 °C gedurende 3 min. Laad 15 μL geëuteerde eiwitmonsters in de standaard Laemmli-buffer op 4-20% SDS-PAGE-gel naast de eiwitladder en voer de gel uit met een standaard lopende buffer die SDS bevat. Beits de gel met Coomassie blauw en de-stain met water. Analyseer de resultaten van testexpressie om de beste expressieconstructies voor grootschalige productie te identificeren. 4. Preparaten van de met baculovirus geïnfecteerde insectencellen (SCBIIC) voor eiwitproductie Splits 4 dagen voor de geplande productietijd exponentieel groeiende Sf9-cellen tot een uiteindelijke celdichtheid van 2 x10 6 cellen/ml in 125 ml / 250 ml / 500 ml Erlenmeyer glazen shakekolven met schotten in 50 ml / 100 ml / 200 ml insectserumvrij medium met 1% (v/v) definitief antibioticum-antimycoticum. Voeg 0,150 ml / 0,300 ml / 0,6 ml geschikte P2-virussen toe, incubeer geïnfecteerde cellen bij 165 tpm op een orbitale shaker met een slag van één inch en bij een lagere temperatuur van 25 °C om de celdeling te vertragen. Controleer na 4 dagen na infectie cellen onder een microscoop op SOI en ga verder met de productie als de levensvatbaarheid van de cel zoals geverifieerd met Trypan Blue-vlek bijna 70-75% is. 5. Sf9-celpreparaten voor grootschalige eiwitproductie Bereken 4 dagen voor de geplande productietijd het vereiste volume Sf9-cellen voor grootschalige eiwitproductie. Zaad 2 L van exponentieel groeiende Sf9-cellen in Insect Serum-Free Medium tot een celdichtheid van 1 x 106 cellen /ml in 2,8 L Fernbach shakekolven. Incubeer kolven bij 27 °C met schudset bij 150 tpm.OPMERKING: Om bacteriële besmetting in de Sf9-celcultuur te voorkomen, gebruikt u gentamicine tot een eindconcentratie van respectievelijk 10 μg/ml of penicilline/streptomycine tot respectievelijk 50 U/ml en 50 μg/ml. 6. Infectie van de Sf9-cellen met SCBIIS voor de grootschalige eiwitproductie Splits 2 L of 4 L exponentieel groeiende Sf9-cellen in Insect Serum-Free Medium tot een uiteindelijke celdichtheid van 4 x 106 cellen/ml in 2,5 L Tunair shakekolven of 5 L reagensflessen. Voeg 10-12 ml/l van de met baculovirus geïnfecteerde suspensiecultuur (SCBIIC) toe. Incubeer de geïnfecteerde cultuur van Sf9-cellen op een shaker met 145 tpm bij de lagere temperatuur van 25 °C (om de celdeling te vertragen) gedurende 72-96 uur. Controleer na 72 uur na infectie de cellen onder een microscoop op SOI en beoordeel de levensvatbaarheid van de cellen. Meestal daalt de levensvatbaarheid van Sf9-cellen na ongeveer 72 uur na infectie tot 70%-75% (gemeten met trypanblauwe vlek). Oogst geïnfecteerde Sf9-cellen in een polypropyleenfles van 1 L door centrifugeren bij 900 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de celkorrel verzameld uit 1 L van de productiecelcultuur met 20-25 ml 1x PBS door zachtjes te wervelen en over te brengen in 50 ml conische buizen. Draai de celsuspensie gedurende 15 minuten op 900 x g en gooi de PBS-oplossing weg. Resuspendeer de gewassen celkorrel met 20-25 ml van de suspensiebuffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 5% glycerol, 1x proteaseremmercocktail) en vlamvries in vloeibare stikstof; bewaren bij −80 °C tot zuivering.OPMERKING: Zuiveringsprocedures voor de PRMT’s zijn in detail beschreven in het door sgc gepubliceerde document6.