Detección de anticuerpos de dominio de unión al receptor SARS-CoV-2 mediante un bioinformador basado en HiBiT
Summary
El protocolo descrito describe el procedimiento para producir el complejo de proteínas de dominio de unión al receptor HiBiT y su aplicación para la detección rápida y sensible de anticuerpos contra el SARS-CoV-2.
Abstract
La aparición de la pandemia de COVID-19 ha aumentado la necesidad de mejores métodos de detección serológica para determinar el impacto epidemiológico del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2). El creciente número de infecciones por SARS-CoV-2 plantea la necesidad de mejores ensayos de detección de anticuerpos. Los métodos actuales de detección de anticuerpos comprometen la sensibilidad a la velocidad o son sensibles pero requieren mucho tiempo. Una gran proporción de anticuerpos neutralizantes del SARS-CoV-2 se dirigen al dominio de unión al receptor (RBD), uno de los principales compartimentos inmunogénicos del SARS-CoV-2. Recientemente hemos diseñado y desarrollado un RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) altamente sensible y marcado como bioluminiscente para detectar anticuerpos contra el SARS-CoV-2. El siguiente texto describe el procedimiento para producir el complejo HiBiT-RBD y un ensayo rápido para evaluar la presencia de anticuerpos dirigidos a RBD utilizando esta herramienta. Debido a la durabilidad del producto de proteína HiBiT-RBD en un amplio rango de temperaturas y al procedimiento experimental más corto que se puede completar en 1 h, el protocolo puede considerarse como una alternativa más eficiente para detectar anticuerpos contra el SARS-CoV-2 en muestras de suero de pacientes.
Introduction
La reciente aparición de un nuevo coronavirus, el SARS-CoV21, ha causado más de 2.800.000 muertes y 128 millones de infecciones hasta el 30 de marzo de 20212. Debido a la falta de un procedimiento de tratamiento confiable y bien establecido para las terapias clínicas del SARS-CoV-2, se han realizado muchos esfuerzos para restringir la transmisión viral adicional y, lo que es más importante, para desarrollar un tratamiento efectivo y robusto o una vacuna3. Hasta la fecha, hay más de 50 vacunas candidatas contra la COVID-19 en ensayos reportados por la Organización Mundial de la Salud4. La detección de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 es de suma importancia para determinar la estabilidad a largo plazo de la respuesta humoral tras la administración de la vacuna, así como en pacientes recuperados de COVID-195. Algunos estudios han demostrado que existe la posibilidad de que los pacientes recuperados con SARS-CoV-2 pierdan la mayoría de los anticuerpos de unión a RBD después de 1 año5,6,7,8,9. Se requiere más investigación para comprender mejor la inmunidad duradera, y las plataformas de detección de anticuerpos más sensibles pueden ayudar a avanzar en dicho trabajo. Los informes de inmunidad sostenida de infecciones leves por SARS-CoV-2, que sugieren respuestas de anticuerpos a largo plazo, también son un área de estudio interesante y valiosa. Un método rápido y preciso de detección es esencial para monitorear los anticuerpos en los sueros de los individuos para proporcionar más información sobre la inmunidad en la población.
Al igual que otros coronavirus, el SARS-CoV-2 utiliza glicoproteína de espiga que sobresale para unirse a la enzima convertidora de angiotensina-2 (ACE2) para iniciar una cascada de eventos que conducen a la fusión de las membranas viral y celular6,7. Varios estudios han demostrado recientemente que la RBD de la proteína Spike tiene un papel crucial en la obtención de una respuesta de anticuerpos potente y específica contra el SARS-CoV28,9,10,11. En particular, las correlaciones observadas por Premkumar et al. entre el título del anticuerpo de unión a RBD y la potencia de neutralización del SARS-CoV-2 del plasma de los pacientes son consistentes con rbD siendo un compartimento inmunogénico de la estructura del virus9. Con esto en mente, muchas pruebas de diagnóstico disponibles para la detección de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 requieren mucho tiempo y costo, requieren un largo procedimiento de incubación y lavado (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas [ELISA]) o carecen de sensibilidad y precisión (inmunoensayo de flujo lateral [LFIA])12. Por lo tanto, un método serológico complementario cuantitativo y rápido de detección de anticuerpos derivados de COVID-19 con alta sensibilidad, respuesta rápida y costo relativamente bajo serviría a la necesidad de una prueba serológica confiable para la vigilancia epidemiológica del SARS-CoV-2.
En conjunto, las limitaciones de los ensayos serológicos actuales impulsaron la investigación del sistema de notificación bioluminiscente como un posible agente de diagnóstico en futuras seroencuestas. La bioluminiscencia es una reacción enzimática/sustrato natural, con emisión de luz. La luciferasa nanolúcida es la más pequeña (19 kDa), pero el sistema más brillante en comparación con la luciferasa Renilla y la luciérnaga (36 kDa y 61 kDa, respectivamente)13,14. Además, Nanoluc tiene la relación señal/ruido más alta y la estabilidad entre los sistemas mencionados anteriormente. La alta intensidad de señal de Nanoluc permite la detección de cantidades incluso muy bajas de fusiones de reporteros15. La Tecnología Binaria Nanoluc (NanoBiT) es una versión dividida del sistema Nanoluc, que se compone de dos segmentos: BiT pequeño (11 aminoácidos; SmBiT) y BiT grande (LgBiT) con interacciones de afinidad relativamente baja (KD = 190 μM) para formar un complejo luminiscente16. NanoBiT se utiliza ampliamente en diversos estudios que implican la identificación de interacciones proteína-proteína15,17,18,19 y vías de señalización celular11,20,21.
Recientemente, se introdujo otro pequeño péptido con una afinidad claramente mayor con LgBiT (KD = 0.7 nM), a saber, el sistema HiBiT Nano-Glo, en lugar de SmBiT. La alta afinidad y la fuerte señal del ensayo Nano-Glo “add-mix-read” hacen de HiBiT una etiqueta peptídica luminiscente, cuantitativa y adecuada. En este enfoque, la etiqueta HiBiT se agrega a la proteína objetivo mediante el desarrollo de una construcción que impone una interferencia estructural mínima. La fusión de la proteína HiBiT se uniría activamente a la contraparte lgBiT, produciendo una enzima luciferasa altamente activa para generar bioluminiscencia detectable en presencia de reactivos de detección (Figura 1). Del mismo modo, desarrollamos un sistema basado en HiBiT Nano-Glo para medir fácilmente el título de anticuerpos neutralizantes en los sueros de individuos recuperados de SARS-CoV-2 y recientemente desarrollamos un RBD sarS-CoV-2 marcado con HiBiT. Este artículo describe el protocolo para producir el bioreportaje HiBiT-RBD utilizando procedimientos y equipos de laboratorio estándar, y muestra cómo este bioreportero se puede utilizar en un ensayo rápido y eficiente para detectar anticuerpos dirigidos al SARS-CoV-2 RBD.
Protocol
Representative Results
Discussion
El creciente número de personas infectadas con el SARS-CoV-2 y el esfuerzo continuo para la vacunación mundial requieren pruebas serológicas sensibles y rápidas que puedan usarse en seroencuestas a gran escala. Investigaciones recientes muestran que los bioreporteros basados en nanoluciferasa dividida se pueden utilizar para desarrollar tales ensayos. Recientemente desarrollamos el bioreportaje HiBiT-RBD para diseñar una prueba que se puede utilizar para detectar anticuerpos específicos del SARS-CoV-2 en el suero d…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos y agradecemos la asistencia técnica de Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin y Christiano Tanese De Souza. También agradecemos a Mina Ghahremani por el diseño gráfico. También nos gustaría agradecer a todas las personas que participaron y donaron sus muestras de sangre para este estudio. DWC es apoyado en parte por la Facultad y el Departamento de Medicina de uOttawa.
Materials
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga 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| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
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